Отрицательная иммуномагнитная селекция: метод очистки В-клеток из мононуклеарных клеток периферической крови

Аннотация

Источник: Serra S. et al. Анализ на основе ВЭЖХ для мониторинга метаболизма внеклеточных нуклеотидов/нуклеозидов в клетках хронического лимфоцитарного лейкоза человека. J. Vis. Exp. (2016)

Видео объясняет способ очистки В-клеток путем иммуномагнитного нацеливания и отделения от суспензии мононуклеарных клеток периферической крови. Метод включает в себя мечение нежелательных типов клеток специфическими антителами или лигандами (связанными с магнитными частицами), нацеленными на специфические белки клеточной поверхности, которые должны быть истощены из гетерогенной клеточной суспензии путем магнитной сепарации.

Протокол

1. Очистка лейкозных В-клеток путем отрицательного выделения

1. Ресуспендируйте 10⁷ PBMCs/мл в PBS 0,1 % бычьего сывороточного альбумина (BSA) 2 мМ ЭДТА, pH 7,4 (изоляционный буфер).
2. Добавить 10 мкг мышиных моноклональных анти-CD3, -CD14 и -CD16 первичных антител на 10 7 клеток и инкубировать в течение 30 мин при 4 °С.
3. Промойте клетки с изоляционным буфером и центрифугируйте при 500 x g в течение 5 минут при 4 °C.
4. Ресуспендировать клетки в изоляционном буфере при^10-7 ПММК/мл.
5. Перед инкубацией с клетками ресуспендируйте в флакон овечьи антимышиные магнитные шарики IgG. Переложите в пробирку 100 мкл шариков на 10⁷ клеток.
6. Добавьте 1 мл изоляционного буфера и поместите пробирку в магнитный держатель на 1 мин. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 5 мл.
7. Снимите трубку с магнита и снова суспендируйте промытые шарики в 100 мкл изоляционного буфера.
8. Инкубируйте 10⁷ клеток со 100 мкл магнитных шариков в течение 30 мин при 4 °C с осторожным наклоном и вращением.
9. Поместите пробирку в магнитный держатель на 2 минуты и перенесите надосадочную жидкость с несвязанными клетками CD19⁺/CD5⁺ в свежую пробирку с помощью пипетки объемом 5 мл.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Человеческая кровь
очищенный анти-CD3, -CD14, -CD16	Сделано на собственном предприятии		мышиный моноклональный
Dynabeads овечий антимышиный IgG	Инвитроген	11031 Номер 11031
Фосфатно-солевой буфер (PBS)	Амреско	Э404-200ТАБС	Таблетки
Бычий сывороточный альбумин (БСА)	ID биография	1000-70	Стандартная марка
Изоляционный буфер			PBS 0,1% BSA 2 мМ ЭДТА, pH 7,4
Магнит DynaMag-15	Инвитроген	12301Д	Динальный магнитный сепаратор шариков