1. Приготовление стандартных и ингибиторных исходных растворов
- Для приготовления АМФ отвесить 0,00345 г АМФ и растворить его в 5 мл бессывороточной среды, чтобы получить 2 мМ стандартный раствор АМФ.
- Для приготовления АДО отвесить 0,00265 г АДО и растворить его в 5 мл бессывороточной среды, чтобы получить 2 мМ стандартный раствор АДО.
- Для приготовления ИНО отвесить 0,00268 г ИНО и растворить его в 5 мл бессывороточной среды до получения 2 мМ стандартного раствора ИНО.
- Приготовьте 400 мкМ раствор АМФ, АДО и ИНО, смешав 1 мл стокового раствора 2 мМ с 4 мл бессывороточной среды (5 мл конечного объема).
- Для получения концентрации 100 мкМ в соотношении 1:4 с получением концентрации 100 мкМ путем пипетирования 500 мкл 400 мкМ раствора в 1 500 мкл бессывороточной среды (2 мл конечного объема).
- Готовят серийные разведения каждого соединения в бессывороточной среде для получения следующих концентраций: 100 мкМ - 50 мкМ - 25 мкМ - 10 мкМ - 5 мкМ - 2,5 мкМ - 1 мкМ - 0,5 мкМ - 0,25 мкМ.<бр/>
Примечание: Например, пипетку внесите 1 мл раствора 100 мкМ в 1 мл бессывороточной среды (разведение 1:2) до получения концентрации 50 мкМ и продолжайте с оставшимися разведениями.
- Приготовьте 10 мМ стоковый раствор APCP, растворенный в PBS; аликвоту и стоковый при -30 °С.
- Приготовьте 10 мМ исходных растворов ЭХНА гидрохлорида, дЧФ и дипиридамола, растворенных в диметилсульфоксиде (ДМСО); аликвоте и запасе при -30 °С.
2. Программирование метода ВЭЖХ
- Приготовьте буфер из ацетата аммония массой 7 мМ, растворив 0,770 г ацетата аммония в 2 л дважды деионизированной воды (буфер А). Отрегулируйте pH до 3,0 с помощью соляной кислоты.
- Подготовьте стеклянную бутылку, содержащую не менее 2 л сверхчистого ацетонитрила для ВЭЖХ (буфер В) и подсоедините защитную колонку и колонку к ВЭЖХ.<бр />
Примечание: Столбцы и буферы находятся в состоянии RT во время использования.
- Войдите в программное обеспечение для ВЭЖХ и нажмите кнопку «Обзор проекта». Перейдите в меню «Файл» и выберите «Новый метод», а затем «Метод инструмента».
- Запрограммируйте метод столбца уравновешивания в соответствии с таблицей 1. Установите скорость потока 1,00 мл/мин и запрограммируйте УФ-детектор на считывание с длиной волны 260 нм. Сохраните метод инструмента и снова выберите "новый метод" в меню "файл", а затем "набор методов". Выберите ранее сохраненный метод инструмента и сохраните текущий набор методов с тем же именем.
- Повторите шаг 2.3 для программирования метода выборки прогона, указанного в таблице 2. Установите скорость потока 1,00 мл/мин и запрограммируйте УФ-детектор на считывание с длиной волны 260 нм. Сохраните метод инструмента и повторите ту же процедуру, что описана в шаге 4.4, чтобы сохранить набор методов.
- Нажмите кнопку «Запустить сэмплы», выберите «новый метод набора сэмплов» в меню «Файл».
- Выберите вариант «пустой» и введите номер флакона (в автосамплере), название образца, объем впрыска (50 μл). Выберите сохраненный ранее набор методов в столбце "набор методов" и введите общее время выполнения (мин).
Примечание: Введите метод столбца уравновешивания (Таблица 1) в столбец «набор методов» перед каждым прогоном образца и введите общее время выполнения (мин).
3. Построение стандартной калибровочной кривой для каждого соединения
- Вводите 50 мкл бланка (специфическая бессывороточная среда, не содержащая аденозиндезаминазы) и каждого стандартного образца методами, описанными в Таблице 1 и Таблице 2.
- Используйте метод уравновешивающей колонны (Таблица 1) перед каждым прогоном выборки и устанавливайте условия градиента, описанные в Таблице 2, чтобы получить адекватное разделение пиков. В таблице 3 приведены данные о времени хранения AMP, ADO и INO в этих условиях ВЭЖХ.
- Определите пиковую площадь АМФ, АДО и ИНО при разных концентрациях, выбрав кнопку «процесс» в программном обеспечении ВЭЖХ, а затем опцию «интегрировать». В качестве альтернативы можно вручную выбрать начальную и конечную точки каждой вершины.
- Нанесите график пиковых площадей в зависимости от номинальной концентрации каждого стандарта, чтобы получить девятиточечную калибровочную кривую (100, 50, 25, 10, 5, 2,5, 1, 0,5, 0,25 мкМ).
- Вычислите уравнение прямой для AMP, ADO и INO: y = mx + b,
где x — концентрация μM, а y — площадь пика.
См.
Сталь
| Время | Расход (мл/мин) | %А | %Б |
| 1.00 | 100 | 0 |
| 1.24 | 1.00 | 100 | 0 |
| 6.22 | 1.00 | 2 | 98 |
| 18.65 | 1.00 | 2 | 98 |
Таблица 1: Метод уравновешивающей колонны. Схематическое изображение изменений растворителя для уравновешивания колонны. Буфер А: 7 мМ ацетата аммония, pH 3,0. Буфер В: ацетонитрил.
См.
См.
| Время | Расход (мл/мин) | %А | %Б |
| 1.00 | 0 | 100 |
| 3.74 | 1.00 | 0 | 100 |
| 13.71 | 1.00 | 15 | 85 |
| 17.00 | 1.00 | 100 | 0 |
| 20.00 | 1.00 | 100 | 0 |
Таблица 2: Запуск примера метода. Схематическое изображение изменений растворителя для измерения пуриновых соединений в ВЭЖХ. Буфер А: 7 мМ ацетата аммония, pH 3,0. Буфер В: ацетонитрил.
| Срок хранения | λмакс |
| ампер | 8.00 мин | 260 |
| ИНО | 11.00 мин | 260 |
| беспокойство | 11.90 мин | 260 |
Таблица 3: Время удержания пуриновых соединений. Типичное время удержания, наблюдаемое для АМФ, АДО и ИНО. УФ-детектор запрограммирован на считывание с длиной волны 260 нм.
4. Предварительная обработка ингибиторами и инкубация с субстратом (AMP)
- Для тестирования потребления АМФ, генерации ADO и INO без ингибирования транспортеров CD73, ADA и нуклеозидов ресуспендировали очищенные 2 x 106 CD19+/CD5+ клеток ХЛЛ в 250 мкл бессывороточных средних и планшетных клеток в 48-луночном планшете (или в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл).
- Добавьте 250 мкл 400 мкМ АМФ или ингибиторов АМФ плюс для получения конечной концентрации 200 мкМ АМФ. Включите условие об отсутствии субстрата, который будет использоваться в качестве пустого образца.
- Инкубировать от 30 до 60 минут при температуре 37 °C.
- По окончании инкубации соберите 500 мкл надосадочной жидкости в холодные микроцентрифужные пробирки (на льду) и немедленно центрифугируйте при 17 000 x g при 4 °C в течение 5 минут.
- Перенесите надосадочную жидкость в новые микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и сразу же храните при температуре -80 °C или приступайте к пробоподготовке для прогонов ВЭЖХ.
5. Подготовка образцов для ВЭЖХ
- Отфильтруйте надосадочную жидкость в новых микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл с помощью шприцевых фильтров 0,2 мкм. Для фильтрации используйте шприцы объемом 1 мл.
- Если система ВЭЖХ оснащена автосамплером, подготовьте стеклянные флаконы для ВЭЖХ и используйте микровкладыши объемом 0,1 мл для небольших объемов пробы.
- Перелейте не менее 100 мкл образца в стеклянный флакон с помощью микропипетки или стеклянной пастеровской пипетки. Будьте осторожны, чтобы при переносе не было пузырей, и закройте флакон завинчивающейся крышкой.
- В настоящее время образцы готовы к анализу с помощью RP-HPLC.
6. Измерения пуринов в ВЭЖХ
- Нажмите кнопку «Запустить сэмплы»; выберите «новый метод набора сэмплов» в меню «Файл».
- Выберите вариант «пустой» и укажите: номер флакона (в автосамплере), название образца, объем впрыска (50 мкл).
- Выберите метод столбца уравновешивания и метод выборки прогона, описанные в таблицах 1 и таблице 2, соответственно, для всех последующих пустых и выборочных прогонов.
заметка: Задайте метод столбца уравновешивания (таблица 1) перед каждым прогоном выборки.
- Введите 50 мкл бланка (бессывороточной среды) и каждого образца.
- Определите концентрацию пуринов в каждом образце, количественно оцените АМФ, АДО и ИНО, получив пиковые площади в периоды удержания, описанные в таблице 3.
- Выберите кнопку «Обработать», а затем опцию «Интегрировать». В качестве альтернативы можно вручную выбрать начальную и конечную точки каждого отдельного пика, чтобы получить измерение площади. Это делается путем прослеживания линии между начальной и конечной точками вершины.
- Определите концентрацию μМ с помощью уравнения, полученного для стандартной кривой: y = mx + b, где x представляет концентрацию μM, а y — площадь пика, измеренная по неизвестному образцу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пример кривой калибровочного стандарта ADO представлен на рисунке 1, где: x = (область y - 981.02)/40026
- Учитывая, что 2 x 106 клеток были ресуспендированы в 0,500 мл среды, рассчитайте μмоли АМФ, ADO и INO, потребленные и/или произведенные 106 клетками ХЛЛ, используя следующую пропорцию:
моль: 1 000 мл = x мкмоль: 0,250 мл<бр/>
заметка: Мольни в 1000 мл (число моль в 1 л) эквивалентны концентрации мкм, а х - мкм нуклеотидов или нуклеозидов, произведенных 106 клетками. Наконец, переведите μмоли в nmoles, потребленные и/или произведенные 10 6 клеткамиCLL: nmoles = μmoles x 1000
