Внеклеточный метаболизм пуринов: анализ на основе ВЭЖХ для измерения выработки и метаболизма аденозина в лейкозных клетках

Аннотация

Источник: Serra S et al. Анализ на основе ВЭЖХ для мониторинга внеклеточного метаболизма нуклеотидов/нуклеозидов в клетках хронического лимфоцитарного лейкоза человека. J. Vis. Exp. (2016)

Это видео объясняет метод количественной высокоэффективной жидкостной хроматографии с обратной фазой (RP-ВЭЖХ) для измерения метаболизма аденозина и связанных с ним пуринов, образующихся при потреблении АМФ во внеклеточной среде клеток лейкемического рака. Протокол описывает чувствительный, специфичный, надежный и воспроизводимый анализ РФ-ВЭЖХ, разработанный и валидированный для количественного определения внеклеточных пуриновых нуклеотидов и нуклеозидов, продуцируемых очищенными клетками хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ) в различных условиях культивирования.

Протокол

1. Приготовление стандартных и ингибиторных исходных растворов

1. Для приготовления АМФ отвесить 0,00345 г АМФ и растворить его в 5 мл бессывороточной среды, чтобы получить 2 мМ стандартный раствор АМФ.
2. Для приготовления АДО отвесить 0,00265 г АДО и растворить его в 5 мл бессывороточной среды, чтобы получить 2 мМ стандартный раствор АДО.
3. Для приготовления ИНО отвесить 0,00268 г ИНО и растворить его в 5 мл бессывороточной среды до получения 2 мМ стандартного раствора ИНО.
4. Приготовьте 400 мкМ раствор АМФ, АДО и ИНО, смешав 1 мл стокового раствора 2 мМ с 4 мл бессывороточной среды (5 мл конечного объема).
   1. Для получения к....

Результаты

Рисунок 1.Построение внутренней стандартной кривой.Репрезентативная кривая калибровочного стандарта для ADO и полученное относительное уравнение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

....

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Безсывороточная среда AIM V	GIBCO	12055-091	Жидкий (исследовательский сорт)
аденозин 5'-моносфат (АМФ)	Сигма-Олдрич	А1752
аденозин (ADO)	Сигма-Олдрич	А9251
инозин (INO)	Сигма-Олдрич	И4125
ацетонитрил (CHROMASOLV Plus)	Сигма-Олдрич	Номер 34998 (Английский	Класс ВЭЖХ
ацетат аммония	Сигма-Олдрич	9688	7 мМ, pH 3,0
флаконы с короткой нитью	ВВР	Телефонный номер 548-0029	1,5 мл/стакан
микровставки	ВВР	548-0006	0,1 мл/стакан
завинчивающиеся крышки	ВВР	548-0085	9 мм/полипропилен синий
Атлантида dC18 Колонна	воды	186001344	5 мкм, 4,6 мм x 150 мм
Гвардейская колонна Atlantis dC18	воды	186001323	5 мкм, 4,6 мм x 20 мм
Модуль разделения Waters Alliance 2965	воды		Модуль разделения ВЭЖХ
Уотерс 2998 Детектор с фотодиодной матрицей (КПК)	воды		УФ-детектор
Программное обеспечение Waters Empower2	воды

)