Микродиссекции данио рерио эмбриональных тканей глаз

Краткое содержание

В этой статье описывается подход к microdissect данио сетчатки и без пигментного эпителия сетчатки связаны, от одного до трех дней эмбрионы функции организма крыс.

Аннотация

Данио рерио является популярная модель животного для исследования на развитие глаза из-за его быстрого

Протокол

Часть 1: Подготовка перед микродиссекции

1. Решения
   1. E3 среду ⁴ (5 мМ NaCl, 0,17 мМ KCl, 0,33 мМ CaCl ₂ и 0,33 мМ MgSO _4).
   2. Раствор Рингера ^{1, 5} (116 мМ NaCl, 2,9 мМ KCl, 1,8 мМ CaCl _2, 5 мМ HEPES, pH7.2), фильтр стерилизовать.
   3. 5N NaOH.
2. Химическое травление вольфрамовой иглы
   1. Безопасные небольшой химический стакан, содержащий 5N NaOH на чашку Петри на глине.
   2. Прикрепить скрепку на стороне стакана, так что он вступает в контакт с раствором NaOH.
   3. Подключите отрицательный электрод от источника питания постоянного тока на скрепку и положительного электрода к одному концу короткая часть (~ 2 см) из вольфрамовой проволоки.
   4. Оберните другой конец вольфрамовой проволоки с небольшим шариковый пластилин и падения этой целью в раствор NaOH.
   5. Повышение напряжения до примерно 3 В и падение проволоки вверх и вниз в раствор NaOH до хорошую скорость травления достигается. Иглу в хорошем качестве можно обычно запечатлелись в 10 минут.
   6. Вольфрамовой проволоки подвергаются решение будет постепенно стали тоньше. Когда мяч глины падает, с другой стороны провода, который все еще присоединен к положительному электроду будет резкое форму иглы.
   7. Промыть острой иглой с раствором Рингера или E3, чтобы удалить отложения солей.
   8. Прикрепить иглы аппликатора деревянные лентой или иглодержателя для легкой обработки.
3. Культура пластин
   1. Сокол 60 х 15 мм пластинах полистирола культуры готовы использовать для сетчатки микродиссекции.
   2. Для вскрытия РПЭ-прилагается сетчатки, раздавить двух эмбрионов полностью в культуру пластину, содержащую раствор Рингера, чтобы избавиться от клейкости поверхности за 30 минут до вскрытия. Незадолго до вскрытия, вымыть пластины широко раствором свежего Рингера.
4. Эмбрионы сбора и постановки
   1. Взрослых рыбок данио ведутся, как описано ^{4, 5.}
   2. Отдельные родители рыбы в стационарных цистерн разведения попарно делителя ночь перед размножением.
   3. Удалить разделитель после комнате свет включен в следующее утро. Разрешить родителям крест на 10-минутным интервалом каждые полчаса. Отдельные рыбы после каждого перехода.
   4. Поддерживать эмбрионами собрали с каждого пересечения в E3 среду отдельно при 28 ° C.
   5. Этап эмбрионов на 10 до 12 часов после оплодотворения (HPF) и restage непосредственно перед рассечение на конкретные моменты времени, в соответствии с установленными критериями ^{1, 6.}

Часть 2: Dissection - удаление мозга и глаз выдержка ¹

• Процедуры, описанные в этом разделе, являются общими для вскрытия сетчатки (Часть 3А) и РПЭ-прилагается сетчатки (Часть 3B).
• Все прекрасно вскрытия осуществляются при помощи кончика Дюмон щипцов и помогать другой паре Дюмон щипцы для позиционирования ткани. Химическим травлением вольфрамовой иглы могут использоваться для тонкой манипуляции, если необходимо.
• Все прекрасно вскрытия проводятся на ~ 5-8-кратным увеличением при Olympus SZX16 микроскоп с 1X цель или эквивалент.
• Поддерживать эмбрионами в E3 среды в настольный инкубатор при 28 ° C рядом с микроскопом для легкого доступа эмбриона во время вскрытия.
• Столике микроскопа нагревают до 28 ° С пластиной термо чтобы свести к минимуму влияние колебаний температуры на экспрессию генов.

1. Передача эмбриона на конкретной стадии развития, чтобы раствор Рингера в Сокол 60 X 15 мм пластины культуры получали, как описано в части 1 # 3.
2. Отрезанная голова с частью передней ствол быстро из организма.
3. Pin заднем конце этой ткани на культуру пластину с помощи щипцов.
4. Открытая головка на спинной стороне, начиная с переднего лоб.
5. Удалить мозга так, чтобы медиальной стороны глаз подвергается и вверх для дальнейших манипуляций.

Часть 3А: вскрытие сетчатки ¹

1. Подготовка эмбрионов, как описано в Части 2.
2. Тщательно кисти подвергается ПЭС на медиальной стороне глазного яблока, который сталкивается в сторону повышения на кончике пинцета, пока небольшое отверстие в сетчатке видел.
3. Продолжить чистки и пилинга действия до медиальной стороны сетчатки почти все выступающие. Избегайте царапин и штамповки подвергаются сетчатки.
4. Для удаления боковых ПЭС на сетчатке, которая в настоящее время сталкивается вниз, подход, который и кисть под углом примерно 45 ° от поверхности пластины культуры.
5. Удалить НПП, который прилагается довольно твердо ора Серрата, закрепив отдельные части НПП, чтобы сulture пластина для вскрытия, а затем поднимите сетчатки мягко.
6. Ролл сетчатки на дне культуры блюдо для очистки остаточных ППД.
   1. Мы заметили, что этот конкретный полистирола Сокол культуры пластина имеет преимущественное соблюдение НПП в течение приблизительно 20 минут один эмбрион подавлено. Это свойство используется для удаления остатков РПЭ. Тем не менее, клетки сетчатки сделать прилипают к поверхности, в меньшей степени, которые могут быть проверены тесно при большом увеличении. Нужно найти баланс между полнотой НПП удаления и сетчатки целостности.
   2. Линзы часто придерживается культуры пластины и отделяется от сетчатки в процессе прокатки. Иногда, необходимо отделить объектив травления иглы вольфрама с закрученной действие на поверхности линзы.
7. Эти процедуры могут успешно удалить НПП от сетчатки без ущерба для целостности тканей. На это указывает хорошее общее морфологии (рис 1B и B ') и гистологии (рис. 1В "), стрелка, в частности, сохранение внеклеточного матрикса между слоем фоторецепторов и РПЭ является исключительно хорошим (рис. 1В."; сравнить с гистологии со всего эмбриона (рис. 1А ")).

Часть 3B: НПП подключением сетчатки рассечение ³

1. Подготовка эмбрионов, как описано в Части 2.
2. Pin головы до культуры пластины ассистент пинцетом. Поднимите глаза мягко от задней боковой-н-ролл на передней стороне.
   1. Предполагаемого сосудистой оболочки и склеры ткани на внешней стороне слоя НПП крепятся довольно плотно к коже и может быть главным образом снимают прокаткой глаза внимательно передней стороне.
3. Снимите объектив с вольфрамовой иглы после боковой стороне глаз подвергается и тогда, когда глаз еще привязаны к коже.
4. Эти процедуры могут успешно сохранить целый пласт РПЭ с сетчаткой. Фиксированные choroids и склеры ткань может быть в значительной степени удалено (рис. 1С, С и С ").

Часть 4: образец ткани коллекции для работы РНК

1. Расчлененный образцы могут быть собраны в TRIzol в РНКазы без микроцентрифужную трубки для определения характеристик вниз по течению РНК, как описано выше ^1.

Представитель Результаты

Рисунок 1. () Боковые и (') спинной зрения данио личиночной головы на 52 HPF до вскрытия. (") Соответствующей гистологической части личиночной головы () & ('). (В) и бокового (В') спинной зрения расчлененные сетчатки на 54 HPF. Поверхности сетчатки цел с обеих боковых и спинной взглядов. (В ") соответствующей гистологической части расчлененного сетчатки (B) и (В '). Структура сетчатки и сетчатки ламинирования был цел. В частности, внеклеточного матрикса между слоем фоторецепторов и НПП (", стрелки) хорошо сохранился в расчлененный сетчатки (В", стрелки). (C) Боковые и (С) медиальные зрения расчлененные РПЭ-прилагается сетчатки на 52 HPF. НПП слой цел и непрерывным, который также обозначается гистологической части расчлененного ткани (C "). Белую область в С" является зрительного нерва (стрелка). Для гистологии, образцы тканей были собраны и зафиксированы в 4% параформальдегида. Пластиковые вложения и секционирования этих образцов были выполнены, как описано ^3. Шкала бар = 50 мкм.

Обсуждение

Микродиссекция тканей данио глаз может эффективно получить нетронутыми сетчатки и РПЭ-прилагается сетчатки. Это существенно помогает выражение исследований, касающихся конкретных тканей глаза (например, сетчатки или РПЭ). На самом деле, мы успешно использовал эти процедуры, чтобы получить профили РНК выражение целого сетчатки ¹ и НПП ^3. Полезность этих профилей активно поддерживают наше недавнее определение путей и семейств генов, которые в возмущенной сетчатки дифференциации мутантов ^2....

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Беспроводной привод для пестика	VWR international	47747-370
Источник питания постоянного тока	Ласкар	PSU130	Подойдет любой источник питания постоянного тока. Конкретное напряжение для другого оборудования потребуется дополнительно оптимизировать.
Одноразовый пестик &микроцентрифужная пробирка, 1,5 мл (без ДНКаз, РНКаз и пирогенов)	VWR international	47747-366	Они используются для сбора тканей в TRIzol для анализа экспрессии.
Пинцет Dumont #5, кончики: 0,05 x 0,01 мм, Inox	World Precision Instruments, Inc.	500341	Желательно соблюдать заданный размер кончика, однако это требование не является абсолютным, так как может возникнуть необходимость периодически затачивать кончик.
Пинцет Dumont #5SF, кончики: 0,025 x 0,005 мм, Inox	Fine Science Tools	11252-00	Желательно соблюдать заданный размер кончика, однако это требование не является строгим, так как время от времени может возникнуть необходимость в затачивании кончика.
Культуральные планшеты Falcon из полистирола, 60 X 15 мм	BD Biosciences	351007	Эти планшеты используются в качестве планшетов для диссекции.
Стереомикроскоп Olympus SZX16	Olympus Corporation	SZX16	Подойдет любой стереомикроскоп. В предыдущих исследованиях мы использовали стереомикроскоп Leica.1-3 без каких-либо проблем. Кроме того, для диссекции мы используем исключительно объектив 1X, несмотря на установленный объектив 2X.
Заточный камень	Fine Science Tools	29008-01	Используйте это для заточки кончиков пинцета, если необходимо.
Термопластина	Tokai Hit	MATS-U55SZX2B	Это используется для поддержания температуры ткани на протяжении всего процесса диссекции и минимизации влияния температурных колебаний на экспрессию генов. Мы также поместили весь микроскоп в помещение с контролируемыми условиями окружающей среды при температуре 28°C.°С, в ходе диссекции в предыдущих исследованиях1-3 с хорошим результатом.
Trizol, 100 мл	Invitrogen	15596-026
вольфрамовая проволока, диаметром 0,015 дюйма	World Precision Instruments, Inc.	TGW1510
Деревянный аппликатор	Пуританин	807	Это используется для удерживания химически вытравленной вольфрамовой иглы.