Выделение флуоресцентно меченых клеток T-ALL: метод выделения клеток T-ALL от взрослых рыбок данио

Аннотация

Источник: Pruitt, M. M., et al. Выделение популяции побочных бактерий при остром Т-клеточном остром лимфобластном лейкозе, индуцированном Myc, у рыбок данио. J. Vis. Exp. (2017).

Этот протокол описывает технику выделения флуоресцентно меченых Т-клеточных острых лимфобластных лейкозов (Т-ОЛЛ) из взрослой рыбки данио-рерио и их количественного определения с помощью трипанового синего красителя.

Протокол

1. Сбор флуоресцентно меченых клеток T-ALL из первичной опухолевой рыбы

1. Приготовьте не менее 20 мл 10% инактивированной при нагревании фетальной бычьей сыворотки в 0,9x фосфатно-солевом буфере (FBS/PBS).
2. Добавьте 1 мл FBS/PBS в один флакон гепарина и натриевой соли (300 единиц).
3. Выберите рыб, несущих опухоли более чем в 50% тела, или тех рыб, которые испытывают трудности с приемом пищи или плаванием. Принесите рыбу в жертву, передозировав ее трикаином или погрузив в ледяную воду. Подтвердите смерть отсутствием движения жабр и сердцебиения.
4. Используйте лезвие бритвы, чтобы удалить голову рыбы.
5. Промойте полость рыбы раствором гепарина, чтобы удалить излишки эритроцитов.
   1. С помощью пипетки введите 100 μл раствора гепарина (добавьте 1 мл FBS/PBS в один флакон соли гепарина натрия) в полость тела рыбы. Удалите всю вылитую жидкость (в ней будут содержаться клетки крови) и нанесите ее пипеткой в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
   2. Используйте свежий наконечник для пипетки, чтобы снова вымыть тело. Выполняйте не менее трех стирок или до тех пор, пока выливающаяся жидкость не освободится от крови.
   3. На этих этапах выбросьте всю жидкость из стирок, так как она не будет использоваться в дальнейших анализах.
6. Соберите клетки лейкемии.
   1. Введите 100 μL FBS/PBS в полость тела рыбы.
   2. Слегка надавите кончиком пипетки на внешнюю часть тела рыбы, чтобы выдавить/вытолкнуть опухолевые клетки.
      заметка: Если выполнить этот шаг с помощью препарирующего микроскопа, то опухолевые клетки, высыпающиеся из полости тела, будут очевидны.
   3. Соберите жидкость и клетки из каждой промывки в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
   4. Повторяйте шаги 1.6.1-1.6.3 до тех пор, пока не будет собрана большая часть опухолевых клеток (обычно 5-10 раз). Соберите все опухолевые клетки в одну микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Держите клетки при комнатной температуре.
7. Смешайте собранные на предыдущем этапе опухолевые клетки, аккуратно пипетируя их, чтобы диссоциировать скопления клеток. Отфильтруйте клеточную суспензию через сетчатый фильтр толщиной 40 мкм. Промойте фильтр 1-2 раза 100 μл FBS/PBS. Держите клетки при комнатной температуре.
8. Смешайте 2 мкл клеточной суспензии с 18 мкл трипанового синего (0,4%, разведенного в соотношении 1:10 и отфильтрованного) в новой пробирке. Загрузите 10 мкл на гемоцитометр и подсчитайте количество живых (не синих) флуоресцентных клеток, чтобы рассчитать количество выделенных опухолевых клеток.
   заметка: Несиние GFP-отрицательные клетки, вероятно, являются нормальными, незлокачественными Т-клетками и не должны учитываться. Для окрашивания ячеек Hoechst 33342 требуется не менее 2 x 10⁶ элементов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Сингенная рыбка данио (CG2)			Mizgireuv et al., 2006
RAG2:C-MYC плазмида			Лаборатория Лангенау
rag2:GFP плазмида создана в лаборатории де Йонга			Промоутер rag2 от лаборатории Лангенау
pCS2-транспозаза плазмида			Лаборатория Чен
Микроскоп SteREO Discovery V8	Микроскопия Carl Zeiss	495015-0008-000
Трикаин метансульфонат (MS-222)	Вестерн Кемикал, Инк	Fisher Scientific - NC0342409	100 г
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	HyClone Laboratories, Inc.	Fisher Scientific - SH3007103	500 мл
Фосфатно-солевой буфер (PBS)	Gibco от Life Technologies	1001-023	pH 7,4 (1x) - 500 мл
Гепариновая натриевая соль	Сигма-Олдрич	2106	15 - 300 флаконов
Сетчатый фильтр 40 μм	Бренд Falcon Corning	352340 (Английский	Кейс из 50
Трипан синий	Сигма Лайф Сайнс	Т8154	20 мл - раствор (0,4%)