$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Окрашивание флуоресцентно меченых клеток T-ALL с помощью Hoechst 33342 для идентификации популяции побочных
продуктов
- Разбавьте Hoechst 33342 1:10 с безнуклеазным H2O до рабочей концентрации 1 мг/мл. Храните краситель при температуре 4 °C и в темноте.
- Приготовьте 100 мМ раствор верапамила, растворив 49,1 мг в 1 мл диметилсульфоксида (ДМСО).
заметка: Верапамил является ингибитором транспортеров ABC и важным средством контроля для экспериментов с побочными популяциями. Добавление верапамила в образцы подавляет способность транспортеров ABC выделять краситель Hoechst 33342. Таким образом, истинная популяция побочных компонентов исчезнет при добавлении верапамила в образец.
- Установите водяную баню на 28 °C.
- Подготавливайте образцы и контрольные элементы в темноте, добавляя клетки и растворы в пробирки с флуоресцентно-активируемым сортировщиком клеток (FACS).
- Подготовьте образцы, добавив 106 клеток, 15 мкл 1 мг/мл Hoechst 33342 и 2,5 мкл ДМСО в пробирку FACS. Отрегулируйте громкость до 1 мл с помощью FBS/PBS.
- Подготовьте контроль, добавив 106 клеток, 15 мкл 1 мг/мл Hoechst 33342 и 2,5 мкл 100 мМ верапамила в пробирку FACS. Отрегулируйте громкость до 1 мл с помощью FBS/PBS.
заметка: Рекомендуется минимум 10-6 клеток/образец, но окрашивание большего количества клеток предпочтительно, особенно если побочные популяционные клетки будут отсортированы для дальнейшего анализа. Не превышайте 106 клеток/мл и поддерживайте концентрацию Hoechst 33342 на уровне 15 мкг/мл. Если окрашивать 10 x 106 клеток, общий объем реакции составляет 10 мл.
- Выдерживать на водяной бане при температуре 28 °C в темноте в течение 120 минут.
- После инкубации поместите клетки сразу на лед и держите их в темноте.
- Гранулируйте клетки при температуре 4 °C в течение 6 мин при 300 x g. Удалите надосадочную жидкость. Умойтесь 1 мл FBS/PBS.
- Гранулируйте клетки при температуре 4 °C в течение 6 мин при 300 x g. Удалите надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в 1 мл FBS/PBS.
- Держать при температуре 4 °C до сортировки клеток.
- За 15 минут до сортировки клеток добавьте 2 мкл запаса йодида пропидия (PI) (1 мг/мл) в каждый 1 мл FBS/PBS (конечная концентрация: 2 мкг/мл). Хорошо перемешайте.
2. Используйте FACS для поиска боковой популяции в популяции флуоресцентно меченных T-ALL клеток
- Проанализируйте окрашенные суспензии клеток T-ALL рыбки данио на сортировщике клеток, оснащенном УФ-лазером для возбуждения красителя Hoechst 33342 и лазером с длиной волны 488 нм для возбуждения PI и обнаружения клеток GFP+ T-ALL.