Анализ нейропластичности поджелудочной железы in vitro: изучение изменений в нейронах желудочно-кишечного тракта, подвергшихся воздействию экстрактов здоровой и раковой ткани поджелудочной железы человека

Аннотация

Источник: Demir, I. E., et al. Моделирование нейропластичности поджелудочной железы: анализ пластичности двух нейронов in vitro. J. Vis. Exp. (2014).

Это видео демонстрирует анализ нейропластичности in vitro для изучения морфологических изменений в ганглиях дорсальных корешков и нейронах миентерального сплетения, подвергшихся воздействию экстрактов здоровой и раковой ткани поджелудочной железы человека. Этот анализ позволяет нам изучить нарост нейритов, характер ветвления и размер нейронов.

Протокол

1. Выделение нейронов

Как только сбор экстракта/надосадочной жидкости будет завершен, продолжайте выделение нейронов.

1. Для нейронов DRG собирают шейный и поясничный отделы DRG новорожденных крыс в период между 2-м и 12-м днем после обезглавливания и стереомикроскопическим вскрытием DRG (рис. 1A). Для того, чтобы иметь достаточное количество нейронов DRG для 24-луночной пластины, соберите все шейные и поясничные DRG одной новорожденной крысы (равные 52 DRG) на пластину.
2. Отрежьте периферические (нейронные) и центральные выступы (корни) ДРГ с помощью микроножниц. Оставление проекций на месте препятствует растиранию и увеличивает риск загрязнения культуры фибробластами.
3. Для нейронов МП следует вырезать брыжейку из тонкой кишки и вручную и осторожно отделить серомышечный слой тонкой кишки (подробный протокол выделения МП см. на рисунке 1В). Для МП соберите сплетение от двух крыс на 24-луночную пластину.
   заметка: Старайтесь быть как можно более щадящими, чтобы избежать разрывов в серозно-мышечном слое, так как они препятствуют его успешному отделению от тонкой кишки.
4. Соберите ДРГ и серомышечный слой в ледяную минималистическую эфирную среду (МЭМ), снабженную гентамицином (20 мг в среде 500 мл) и метронидазолом (2,5 мг в среде 500 мл).
5. После сбора DRG инкубируйте их в сбалансированном солевом растворе Хэнка (HBSS), снабженном коллагеназой типа II, в течение 20-30 минут. Для выделения МП инкубируйте в коллагеназном типе в течение 1-3 часов, в зависимости от возраста животного (Рисунок 1C).
6. Для МП соберите сетчатые кусочки МП под стереомикроскопом и перенесите в ледяной МЭМ.
7. Затем растираем ДРГ и МП через шприцы с уменьшающимся диаметром.<бр/> заметка: Чрезмерное растирание может разрушить нейроны, но в меньшей степени глиальные клетки.
8. После того, как среда, содержащая DRG или MP, помутнела, центрифугировать суспензию при 93,9 x g в течение 5 минут, отбросить среду и повторно суспендировать в нейробазальной среде (с добавлением 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,5 мМ L-глутамина и 2% B-27).
9. Подсчитайте общее количество клеток (т.е. нейронов И глии) с помощью гемоцитометра.
   заметка: Количество необходимых ячеек зависит от измеряемого параметра. Для количественной оценки плотности нейритов необходимы более плотные культуры и, следовательно, большее количество клеток, чем для измерения роста нейритов, перикарионального размера и характера ветвления отдельных нейронов. Для измерения плотности нейритов используйте, например, 10 000 клеток (нейрон + глия) / скважина или 1 500 нейронов / скважина. Для морфометрии отдельных нейронов рекомендуется краткая (продолжительностью 1 минута) трипсинизация клеток и посев 2500 клеток/лунка или 400 нейронов/лунка. Типичный выход клеток, полученных от одной крысы, составляет около 300 000-500 000 клеток.
10. Засейте клетки на покровные стекла толщиной 13 мм, которые были покрыты накануне вечером, и засейте лунки нейробазальной средой (с добавлением 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,5 мМ L-глутамина и 2% B-27) (рис. 1D).
    заметка: Используйте поли-D-лизин (40 мг/^м2) ИЛИ покрытые орнитином и ламинином покрытием (1 мг/мл каждая). Клетки очень быстро прикрепляются к поли-D-лизину, что делает его пригодным для экспериментов, в которых требуется много клеток (например, для измерения плотности нейритов). Прикрепление к ламинину в целом несколько слабее, но ламинин является сильным стимулятором роста нейритов. Поэтому для измерений разветвления нейронов и длины нейритов отдавайте предпочтение орнитинному/ламининовому покрытию.
11. Дайте ячейкам прикрепиться к лункам на ночь. На следующий день приготовьте среду с добавлением экстракта (при конечной концентрации экстракта/надосадочной жидкости 100 мкг/мл).
12. Отсадите затравочную среду и выполните необязательную, очень щадящую промывку PBS, а затем медленно пипетируйте экстракт/среду с добавлением надосадочной жидкости (рис. 1E).
13. Дайте клеткам расти в течение 48 часов. Аспирируйте среду и фиксируйте в 4% параформальдегиде для иммуноокрашивания (Рисунок 1F).
14. Проведите двойное иммунофлуоресцентное окрашивание с использованием нейрон-специфичных (например, бета-III-тубулина) и глиа-специфичных (например, глиального фибриллярного кислого белка/GFAP) маркеров (рис. 1G).
15. Для морфометрии используется микроскоп с инвертированным светом, оснащенный ПЗС-камерой в сочетании с автоматизированным программным обеспечением, позволяющим измерять плотность нейритов (см. таблицу).
16. Плотность нейритов нейрональных культур измеряют на 4-5 репрезентативных микрофотографиях при 200-кратном увеличении из 4 различных областей наиболее плотного роста на каждом покровном листе путем наложения сетки размером 50 мкм х 50 мкм и подсчета плотности волокон на квадрат, измеренной в пересекающихся волокнах. Вырост нейритов, среднее число ветвей на нейрон, средняя длина ветви и размер перикарионов могут быть измерены по случайно выбранным 30 одиночным нейронам из каждого покровного листа путем маркировки нейритов и перикарий (рис. 1H).

Результаты

Рисунок 1. Схематический протокол анализа нейропластичности in vitro. В настоящем анализе используются нейроны ганглиев дорсальных корешков (DRG) и миентерального сплетения (MP) новорожденных крыс для изучения влияния экстрактов ткани поджелудочной железы или клеточных супернатантов на морфологию нейронов и глии. ДРГ собирают после передней ламинэктомии и МП-содержащий серо...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Гидробромид поли-D-лизина	Сигма-Олдрич	П1149
Орнитин/ламинин	Сигма-Олдрич	П2533/Л4544
Покровные стекла 13 мм	Мерк		Для использования в 24-луночных планшетах
Мембранатор S	Сарториус
Антитела к бета-III-тубулину	Многородность	MAB1637	1:200 концентрация
Антитела к GFAP	ДАКО	М0761	1:400 концентрация
RIPA буфер + ингибитор протеазы			Любой поставщик
Нейробазальная среда	Gibco/Медико-биологические науки	No 21103-049
Дополнение к B-27	Gibco/Медико-биологические науки	17504044	Известно, что качество В-27 зависит от количества партии
Гентамицин/Метронидазо			Любой поставщик
Минимальная необходимая среда	Gibco/Медико-биологические науки	31095-029 (Английский)
Сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS)	Gibco/Медико-биологические науки	24020133	Улучшает активность коллагеназы при содержании Ca/Mg
Коллагеназа II типа	Уортингтон Биохимический	КЛС-2	Получение партий с активностью не менее 200 U/mg
Трипсин-ЭДТА 0,25%	Gibco/Медико-биологические науки	25200056
4% параформальдегида			Любой поставщик
Программное обеспечение AnalySIS docu	Олимп