Анализ фосфатазы в клетках КРР: метод изучения статуса фосфорилирования тау-белка в клетках колоректального рака

Аннотация

Источник: Huda, M. N., et al. анализ на фосфорилирование и связывание микротрубочек, а также локализацию тау-белка в клетках колоректального рака. J. Vis. Exp. (2017)

Это видео описывает протокол оценки статуса фосфорилирования тау-белка с помощью анализа фосфатазы в клетках колоректального рака. Фермент фосфатаза действует на фосфатные группы, присутствующие в тау-белке, увеличивая подвижность тау-белка в геле SDS PAGE по сравнению с необработанными образцами тау-белка.

Протокол

1. Анализ фосфатазы

1. Обрабатывайте клеточные лизаты, когда клетки достигают ~65% конфлюенции (аппроксимируется с помощью микроскопии), удаляйте среду с добавлением MEM и добавляйте бессывороточный MEM с 5 мкМ, 10 μМ и 30 μМ куркумином или 25 мМ, 50 мМ и 100 мМ LiCl. Инкубировать при 37 °C в течение 24 ч во влажной атмосфере, содержащей 5%_CO2, через 24 ч после обработки промыть клетки 1 мл ледяного фосфатно-солевого буфера (PBS) и соскоблить клетки с помощью скребка. Переложите скребковые ячейки в центрифужные пробирки объемом 1,5 мл и центрифугируйте в течение 4 минут при 1 800 x g при 4 °C для получения клеточных гранул. Лизируйте клетки, суспендируя гранулы в 100 мкл полного буфера RIPA при температуре 4 °C в течение 20 минут, регулярно постукивая по пробиркам. Кратко обработайте образцы ультразвуком. Центрифугируйте гомогенаты клеток в настольной центрифуге при давлении 22 570 x g в течение 20 мин при 4 °C. Перенесите надосадочную жидкость в другие меченые пробирки с помощью пипетки с щелочной фосфатазой в буфере щелочной фосфатазы.
   1. Как для контрольных, так и для обработанных образцов приготовьте образцы объемом 20 мкл, содержащие 20 мкг белка. Добавьте объем клеточных лизатов, который содержит 20 г белка, за которым следуют 2 μL буфера щелочной фосфатазы и 10 μL щелочной фосфатазы. Добавьте дистиллированную воду до 20 мкл.
2. Образцы инкубируют при 37 °C в течение 1 ч. Остановите реакцию, добавив этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) в конечной концентрации 50 мМ, или добавив ортованадат натрия (Na₃VO₄) в конечной концентрации 10 мМ. Реакцию также можно остановить, нагрев до 75 °C в течение 5 минут.
3. Перед инкубацией образцов с фосфатазой следует подготовить образцы той же концентрации без добавления фосфатазы для сравнения с образцами, обработанными фосфатазой.
4. Добавьте свежеприготовленный гелеобразовательный буфер 4X SDS, содержащий 400 мМ DTT.
5. Инкубируйте образцы на нагревательном блоке при температуре 100 °C в течение 5 мин. Перемешайте образцы с помощью вортекса. Остудить при комнатной температуре ~10-15 минут.
6. Соберите систему электрофореза для запуска 10% полиакриламидного геля с помощью SDS-PAGE.
   1. Загрузите 10 г белка (образец 13 мкл) в лунку в 10% полиакриламидный гель. Нагрузите лестницу с молекулярным грузом.
   2. После загрузки образца подключите положительный и отрицательный электроды системы электрофореза к источнику питания для поддержания постоянного напряжения. Первоначально начните с напряжения 70 В в течение 20 минут, чтобы переместить образцы белка из укладывающего геля в разрешающий гель. Затем увеличьте напряжение до 125 В и запустите гель примерно на 70-120 минут, пока образцы и белковая лестница не достигнут конца геля.
   3. После завершения электрофореза перенесите гель на мембрану из ПВДФ с помощью системы влажного электроблоттинга. Перенос в течение ~100 мин при 100 В.
   4. Отметьте кляксу, сделав небольшой надрез сбоку от молекулярной лестницы. Используйте прозрачный пластиковый лист и острый резак для резки кляксы.
7. Заблокируйте мембрану в буфере, блокирующем 4% BSA, на 90 минут при комнатной температуре.
8. Инкубируйте блот в растворе первичных антител (анти-тау в соотношении 1:5000) при температуре 4 °C в течение ночи. Промойте кляксу в PBST четыре раза, по 7 мин каждый.
9. Приготовьте соответствующий раствор вторичных антител (козий IgG против мышей в соотношении 1:5000) и инкубируйте блот в течение 90 минут при комнатной температуре. Стирать в PBST четыре раза, по 7 мин каждый.
10. Проявите блот с помощью набора для хемилюминесценции в соответствии с рекомендациями производителя. Накройте кляксу прозрачной полиэтиленовой пленкой. Получение изображений с помощью системы хемилюминесцентной визуализации для хемилюминесценции с помощью соответствующего программного обеспечения.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Ячейка HCT 116	АТКС	ССЛ-247
Тарелка 100 мм	Корнинг	430161
MEM (EBSS)	Гиклон	SH30024.01
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	ТермоФишер (Gibco)	16000044	Хранить при температуре -20 °C
Антитела к Tau 13	Абкам	АБ19030
Дитиотреитол (DTT)	Рош	10 708 984 001	Температура хранения 2–8 °C
Куркумин	Сигма-Олдрич (Флюка)	78246	Температура хранения 2–8 °C
Антитела к тау (фосфо S396)	АБКАМ	АБ109390
FastAP Термочувствительная щелочная фосфатаза	Термо Сайентиал	ЭФ0651	Хранить при температуре -20 °C
ПМСФ	сигма	П7626	Хранить при комнатной температуре
Коктейль ингибиторов фосфатазы	Сигнализация сотовой связи	No 5870	Хранить при температуре 4 °C
Коктейль ингибиторов протеазы	Сигнализация сотовой связи	No 5871	Хранить при температуре 4 °C
Вторичное антитело IgG к мышам у коз	ТермоФишер	А-11005	Хранить при температуре 4 °C в темноте
Додецилсульфат натрия (SDS)	Аффиметрикс	75819
Молекулярный имиджер	Био-Рад	ChemiDoc XRS+	Хранить при температуре 4 °C
Буфер RIPA	сигма	Р 0278	Температура хранения 2–8 °C
Тритон Х-100	Сигма-Олдрич	Х - 100	Хранить при температуре около 25 °C
Мембрана из ПВДФ	Био-Рад	162-0177 (Английский)
Вторичное антитело IgG к мышам у коз	ТермоФишер	А-11005	Хранить при температуре 4 °C в темноте
Додецилсульфат натрия (SDS)	Аффиметрикс	75819
Реагент для анализа белка на красителях	Био-Рад	500-0006
Звуковой Дисмембратор	Научный центр Фишера	Модель 500
Микролитровые центрифуги	Hettich Zentrifugen	МИКРО 200 Р