Методическая статья

Судьба картирование человеческих эмбриональных стволовых клеток на формирование тератома

19K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/2036

⸱

1 августа 2010 г.

 , 
1Cardiovascular Research Institute, Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research, University of California San Francisco

В этой статье

Краткое содержание

Направленной дифференцировки ЭСК в специфические клетки вызвал большой интерес в регенеративной медицине. Мы предоставляем краткие, шаг за шагом протокол для определения В естественных условиях Судьбу выбранного ЭСК, которая обеспечивает ценный инструмент для характеристики тканеспецифические реагентов для клеточной терапии.

Аннотация

Человека эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) обладают неограниченной способностью к самообновлению, и способность дифференцироваться в клетки, полученные из всех трех эмбриональных зародышевых листков (1). Направленной дифференцировки ЭСК в специфические типы клеток вызвало большой интерес в области регенеративной медицины (например, (2-5)), и методы определения

Протокол

Письменный протокол ниже, основывается на опубликованных параметров сообщают авторы, с некоторыми изменениями. Протокола осуществляется с одобрения UCSF Институциональные уходу и использованию животных (IACUC) и Исследования стволовых клеток надзора (SCRO) комитетов.

I. культуры человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК)

  1. Расти ЭСК в стандартной 6-а (3,5 см в диаметре скважин) пластин.
  2. По крайней мере за 12 часов до пассажей клеток, семян мышиных эмбриональных фибробластов (MEF, полученные из CF1 день e12.5 приурочен-лых мышей, облученных при 1000 Ки) фидерных клеток на пластинах покрыта 1% желатина (6,7). MEFs должны быть покрыты на 50-60% слияния, или 4 х 10 5 клеток на 3,5 см в диаметре скважины (рис. 1).
  3. Прохождение клеток при колонии достигла ~ 70% слияния (рис. 2).
  4. Для прохождения клетки, аспирацию роста KSR среды (6) из колодцев и заменить с 0,5 мл среды, содержащей коллагеназы IV в KSR при концентрации 1 мг / мл.
  5. Инкубируйте пластин с коллагеназы IV при 37 ° C / 5% CO 2 в течение 5 минут или пока края колонии начинают снять с плиты.
  6. Удалить коллагеназы IV от плиты, добавить 0,5 мл KSR в каждую лунку, так и вручную очистить клетки, чтобы полностью удалить из пластины.
  7. Сбор клеточной суспензии из каждой лунки, место в 15 мл коническую трубку, и позволяют клеткам урегулировать под действием силы тяжести в течение 5 минут.
  8. Удалить супернатант из трубки, в результате чего клетки и среды в общем объеме 300 мкл ~.
  9. Использование 200 мкл микро-дозаторов устанавливается в полном объеме, аккуратно пипеткой клеточной суспензии 5-6 раза, чтобы разбить колоний.
  10. Принесите клеточной суспензии с общим объемом 9 мл на оригинальные и ячеек с помощью KSR среде (то есть, если один хорошо собирается, трубка должна содержать 9 мл). Дополнение среде с рекомбинантный человеческий основной фактор роста фибробластов (bFGF) до концентрации 12,5 нг / мл.
  11. После мытья новых скважин содержащих MEF клеток (см. шаг 2) с фосфатом Дульбеко буферного раствора (DPBS), чтобы удалить все сыворотки, добавляют 3 мл клеточной суспензии в каждую лунку и инкубировать пластин при 37 ° C / 5% СО 2.
  12. Изменение KSR среде с bFGF 24 часов после прохода, и каждые 24-48 часов, пока клетки готовы к пассировать еще раз.

II. Подготовка чЭСК гранулы для пересадки

  1. На 24 часов до пересадки, добавьте ROCK ингибитор KSR средней конечной концентрации 10 мкм увеличить жизнеспособность клеток (8). Одним из хорошо клеток на ~ 70% слияния (5 х 10 5 клеток) приведет к созданию двух гранул, с двумя гранулы вставляется в почечную капсулу.
  2. Для подготовки клетка таблеток для пересадки (9), инкубировать ROCK ингибитор обработанных культур с коллагеназы IV в течение 5 минут при 37 ° C / 5% СО 2.
  3. Аспирируйте коллагеназы IV из колодца и заменить с 1 DPBS мл с 10% пенициллина / стрептомицина (ручка / стрептококк).
  4. Вручную очистить колоний от пластины, полоскание хорошо с дополнительно 1 мл DPBS пером / стрептококк, и передача каждого 1 мл аликвоту суспензии клеток в 1,5 трубки микроцентрифужную мл.
  5. Спиновые микроцентрифужную труб кратко в 8000 х г, аспирация супернатант, и ресуспендируют гранул в 500 мкл DPBS пером / стрептококк.
  6. Чтобы помочь связывают клетки между собой для трансплантации, добавьте 100 мкл 1 мг / мл Phaseolus обыкновенная лектина (PHA) в DPBS в каждую пробирку.
  7. Инкубируйте клетки / PHA суспензии при комнатной температуре в течение 5 минут, затем спина в течение 2 минут при 8000 х г. Поворот трубы на 180 ° в пределах их ротора скважин и спина снова в течение 2 минут при 8000 х г.
  8. Тщательно аспирата супернатант оставляя осадок нетронутыми.
  9. Выбить ячейки гранул из трубы, осторожно пипеткой 200 мкл KSR рядом с краем гранул, пока она медленно поднимается.
  10. Как только смещаются, немедленно передать гранулы 0.4μm MILLICELL вставки помещается в 3,5 см в диаметре скважин, содержащий 3 мл KSR, и выдержать в течение 2 часов ночи при 37 ° C / 5% СО 2.

III. Почечная капсула прививки

  1. Выполнение всех животных процедур в соответствии с руководящими принципами институциональной с использованием соответствующих правил асептики.
  2. Обезболить SCID бежевый мышей (CB17.Cg-Prkdc SCID лизатора BG / CRL), в возрасте 8-12 недель, используя сочетание ингаляционных 3% isoflurane/0.5% O2 и внутрибрюшинного tribromoethanol (Avertin; 25 мг / кг свежеприготовленный). Две ячейки гранул на мышь будет привита использованием описанных техник (10).
  3. После размещения мыши на грелку, чтобы предотвратить переохлаждение, побриться области разреза, то вылечить хлоргексидином. Сделать 2,5 см разрез через кожу недалеко от центра, но параллельно позвоночнику.
  4. Хранение влажного области разреза стерильным Салине, сделать меньше разрез через мышцу, чуть ниже ребер и ~ 1 см от позвоночника. Разреза должна быть достаточно большой, чтобы тянуть через почки, но мало, что почки не скользят обратно в брюшную полость без применения силы.
  5. Вытяните почек мягко через разрез мышцы с помощью стеклянной пипетки Пастера, который был втянут в форме тупого, слегка изогнутые трубки.
  6. Влажные почек стерильным DPBS для предотвращения капсулы от высыхания. Это может быть необходимо повторять на протяжении всей процедуры, так как капсула очень хрупкая.
  7. Использование Дюмон # 5 пинцетом, осторожно потяните капсулы по сравнению с почками и сделать 2 мм разрез с помощью ножниц Vannas весной.
  8. С другой стеклянной пипетки, которые были втянуты в очень тонкий, притупляются зонд, сделайте небольшой карман между капсулой и почек.
  9. Использование большого отверстия пипетки помещают на одноразовые пипетки передачи, принять единый клеточный осадок от вставки MILLICELL. Убедитесь в том, чтобы занять всего лишь дополнительные средства массовой информации по возможности, как избыток средств массовой информации может помешать передаче гранул.
  10. Удерживая до края разреза, чтобы создать карман, осторожно положите шарик рядом с открытия и столкнуть ее в карман к одному полюсу почки с вытащил пипетки.
  11. Повторите процесс со второй гранул. Место это под капсулой из другого теста, а на противоположном полюсе.
  12. Осторожно поместите капсулу обратно вниз на гранулы. Гранулы должны оставаться в пределах кармана, а не швы необходимо закрыть капсулы.
  13. Аккуратно нажмите почек обратно в брюшную полость и закрыть мышц стене с помощью 4-0 швов шелк (или меньше) с прикрепленными обратного резки иглы. Разрез должен быть достаточно небольшим, что только один шов необходимо.
  14. Закрыть кожи серии 4-5 прервал стежки, используя те же шовный материал.
  15. Перед размещением мышь обратно в свою клетку, администрирования 0,05 мг / кг бупренорфин (11,12) и 5 ​​мг / кг кетопрофен (12,13) ​​в качестве краткосрочных и долгосрочных анальгетики, соответственно. Регулируемые вещества должны использоваться только в соответствии с ведомственным руководящим принципам.
  16. Передача животных обратно в клетку и дать ему оправиться от наркоза на грелку. Это должно занять около 20-30 минут.
  17. Как только мышь полностью амбулаторно, оно может быть возвращено на объект жилищного животного.

IV. Тератома сбора, фиксации и секционирования

  1. В 8-12 недель после операции, не должно быть едва ощутимыми тератома возле почек. Большие, наполненные жидкостью кисты часто будет развиваться, а, начиная с 6-8 недель. Эти могут потребовать ранее урожай, если они причиняют страдания животным. С тератомы расти более медленными темпами, чем кисты, однако, вам нужно будет ждать столько, сколько можно получить тератома достаточного размера для анализа (то есть, по крайней мере 8 недель).
  2. Удаление почки, тератома, и любой окружающий кисты в виде блока ткани из брюшной полости с использованием тех же хирургических подход, при котором почка была первоначально доступ (см. раздел III, пункты 1-4 выше).
  3. Место весь блок вырезали ткани в пробирку, содержащую 10% буферный формалин.
  4. Разрешить тератома исправить течение ночи при 4 ° C.
  5. На следующий день, удалить тератомы из тюбика. Рассеките от любых кист и столько почек, возможно, не повреждая тератома себя (рис. 3). Большие тератомы могут быть сокращены в два раза для облегчения рассечения и вложение.
  6. Процесс тератома с использованием стандартного парафином фиксации техники. Автоматизированные устройства доступны (например, Shandon Гиперцентр):
    I. 80% алкоголя Flex 2-х часов
    II. 80% алкоголя Flex 1 час
    III. 85% алкоголя Flex 1,5 часа
    IV. 95% алкоголя Flex 1 час
    V. 100% Flex алкоголя 1 час
    VI. 100% Flex алкоголя 1 час
    VII. 100% Flex алкоголя 1 час
    VIII. Открытый-Rite 3 1 час
    IX. Открытый-Rite 3 1 час
    X. Открытый-Rite 3 1 час
    XI. Парафин (TissuePrep) 2-х часов
    XII. Парафин (TissuePrep) 2-х часов

В. Immunohistochemistry и анализ

  1. Как только в парафин, раздел тератома в 5 мкм серийный ломтики с помощью роторного микротома, и плавать разделы на слайдах.
  2. Перед окрашиванием, испечь слайды, по крайней мере один час.
  3. Пятно слайды гематоксилином и эозином с использованием стандартных методов выявления тканевых структур представителю от каждой из трех эмбриональных зародышевых листков (рис. 4):
    I. Ксилол мыть 3-5 минут
    II. Ксилол 3-5 минут
    III. 100% спирта 3-5 минут
    IV. 100% спирта 3-5 минут
    V. 95% алкоголя 3-5 минут
    VI. 80% алкоголя 3-5 минут
    VII. Вода мытья (несколько изменений) 2 минуты
    VIII. Гилл гематоксилин # 3 2-5 минут
    IX. Вода мытья (несколько изменений) пока вода не станет чистой
    X. Скотт воды (до синего ядер) 3 и более минут
    XI. Вода мытья (несколько изменений) 1-2 минуты
    XII. Eosin Y 1 минута
    XIII. Вода мытья (несколько изменений) 30 секунд
    XIV. 80% алкоголя 1 минута
    XV. 95% алкоголя 2 минуты
    XVI. 95% алкоголя 2 минуты
    XVII в. 100% спирта 3 минуты
    XVIII в. 100% спирта (чистый) 3 минуты
    XIX в. Ксилол 2 минут или больше
    XX в. Ксилол 2 минут или больше
  4. Горы покровное на каждом слайде с Permount.

VI. Представитель Результаты

Рисунок 1
Рисунок 1. Покрытие облученного CF1 мышиных эмбриональных фибробластов в качестве фидерного слоя для культивирования ЭСК недифференцированные. MEFs высевают на ~ 50% слияния, как показано здесь, или 4 х 10 5 клеток на 3,5 см в диаметре и в 6-и культуре блюдо. Бар, 100 мкм.

Рисунок 2
Рисунок 2. Пример subconfluent культуре недифференцированных ЭСК на слой фидерные MEF. ЭСК выращиваются на MEF фидерные слои до ~ 70% сливной, как показано здесь, то пассировать, как описано. Бар, 100 мкм.

Рисунок 3
Рисунок 3. Пример эксплантированных тератомы. После эксплантации, тератома, почек, и любой аксессуар ткани фиксируются как блок в формалине, затем почки и аксессуаров ткани, тщательно отделаны прочь перед вложением в парафин.

Рисунок 4
Рисунок 4. Тератомы производных из недифференцированных ЭСК содержат тканей представителем всех трех зародышевых листков в естественных условиях. Тератома, например, один изображен на рисунке 3, была разделена и окрашивали гематоксилином и эозином для идентификации эмбриональных тканей. ЭСК приводит к тканям производных от всех трех эмбриональных зародышевых листков (эктодермы (А, В), мезодермы (С), энтодермы (D). (А) находятся в стадии становления нейронные структуры трубки. (B) Примитивные плоского эпителия. (C) хряща окруженный капсулой уплотненной мезенхимы. (D) Железистая кишечной структуры. Бар, 100 мкм. Изображения перепечатана с разрешения автора.

Рисунок 5
Рисунок 5. Тератома анализ может быть использован для отображения судьбу меченых, недифференцированные ЭСК. Как ранее опубликованных (9), смесь специальные коды для ЭСК с немаркированные ЭСК может быть использована для перевода судьбу меченых клеток в анализе образование тератомы. Как показано здесь, недифференцированные ЭСК выражения поверхности маркер, CD133, и помечены с повышенной зеленого флуоресцентного белка (EGFP), были смешаны с немаркированные, недифференцированные ЭСК. Они были использованы для формирования тератомы путем почечной капсулы прививки. Иммуногистохимический анализ гематоксилином и эозином-окрашенные срезы тератома с анти-EGFP антител свидетельствует судьба нейроэктодермальная из ЭСК CD133 +. Тератомы были обработаны как показано на рисунке 4 и контрастно с анти-EGFP антител (коричневый) для локализации производные CD133 + GFP + клеток в тканях. CD133 +-клеток, полученных из (стрелки) были обнаружены в тканях, возникающие из эмбриональных эктодермы, в частности, нейронных эпителия (слева) и зарождающиеся нервной трубки-подобные структуры (справа). Бар, 100 мкм. Изображения перепечатана с разрешения автора.

Желатин

  • 0,1% свиной желатин
  • 99,9% DPBS
    • Добавить желатин в DPBS, инкубировать при 37 ° С в течение одного часа или пока все желатин переходит в раствор, и фильтр стерилизуют (0.22μm) перед использованием.

MEF среда

  • 10% эмбриональной телячьей сыворотки (квалифицированные)
  • 90% Дульбеко изменения основных среднего (D-MEM)
  • 1x L-глютамин
  • 1x Pen / Strep
    • Фильтры стерилизовать перед использованием.

KSR (Knockout сыворотки Замена) среде

  • 20% Замена KnockOut сыворотки
  • 80% KnockOut D-MEM
  • 1x L-глютамин
  • 1x заменимые аминокислоты
  • 0,1 мМ β-меркаптоэтанол /
  • 12,5 нг / мл bFGF
    • Фильтры стерилизовать.
    • Хранить при температуре 4 ° С, но тепло до 37 ° C перед добавлением к клеткам.
    • Добавить bFGF непосредственно перед употреблением.

Коллагеназы IV

  • Растворите 1 мг / мл в среде KSR, поставив при температуре 37 ° С в течение 1-2 часов или пока все порошок переходит в раствор.
  • Фильтры стерилизовать.

Avertin

  • 0,25 г 2,2,2-tribromoethanol
  • 0,25 мл 2-метил-2-бутанол
    • Инкубировать при 37 ° С в течение ночи в форме 100%-ный раствор.
    • За несколько часов до операции, развести до 2,5% рабочего раствора использованием DPBS и инкубировать при температуре 37 ° С в течение не менее 1 часа.
    • Фильтры стерилизовать и аликвоту.
    • Tribromoethanol очень светочувствительные, так что защищать от света, на всех этапах подготовки и использования.
    • Подготовка не более 12-24 часов перед использованием.

Бупренорфин

  • 1 мг / мл маточного раствора в метаноле
    • Развести до 0,015 мг / мл рабочего раствора использованием стерильных H 2 O.
    • Хранить при -20 ° С до 1 месяца.

Кетопрофен

  • 0,5 мг / мл рабочего раствора в DPBS
    • Добавить DPBS, инкубировать в течение ночи при 37 ° С в течение 1-2 часов или пока все порошок переходит в раствор.
    • Фильтр стерилизуют и хранят при температуре 4 ° C.

Обсуждение

Мы адаптировали высокоэффективного анализа тератома образованию с целью отображения судьба дифференциации в ЭСК в естественных условиях окружающей среды. Небольшое число специально отобранных ЭСК смешивается с недифференцированные ЭСК дикий тип и Phaseolus лектина обыкновенная сформировать осадок клеток. Это привитых под почечную капсулу в иммунодефицитных мышей. Судьба первоначально выбранного ЭСК могут быть определены иммуногистохимии (Рисунок 5), как сообщалось ранее (9). Этот метод обеспечивает ценный инструмент для выявления и генерации тканеспецифические реагентов для клеточной терапии.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Эта работа была поддержана Всеобъемлющее Грант Исследования, проведенные в Калифорнийском Институте регенеративной медицины (RC1-00104), Службы общественного здравоохранения Грант (HL085377) от NHLBI, и подарок от Поллин Фонда HSB

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-метилбутан-2-олSigma-Aldrich240486Авертин
2,2,2-трибром–этанолSigma-AldrichT48402Авертин
шелковые шовные нити 4-0Ethicon Inc.641G
bFGFR&R&D Systems233FB
БупренорфинSigma-AldrichB7536
Clear-Rite 3Fisher Scientific22-046-341
Коллагеназа IVSigma-AldrichC5138
D-MEMInvitrogen11965
ДПБС (дульбекко-фосфатно-сбалансированный солевой раствор)Invitrogen14190
Пинцет Дюпона №5World Precision Instruments, Inc.500233Почечная капсула
Эозин YFisher Scientific23-245-658
Фетальная бычья сыворотка (квалифицированная)Invitrogen26140-079
Спирт FlexFisher Scientific22-046344
Жабра’Гематоксилин №3Fisher Scientific22-050-204
Гемостатический зажим, прямойWorld Precision Instruments, Inc.501241Общая хирургия
Ирисный пинцетWorld Precision Instruments, Inc.15914Общая хирургия
КетопрофенSigma-AldrichK2012
KnockOut D-MEMInvitrogen10829
Заменитель сыворотки KnockOutInvitrogen10828-028
L-глутаминInvitrogen25020-081
вставки MILLICELLEMD MilliporePICM01250
Незаменимые аминокислотыInvitrogen11140-050
Операционные ножницыWorld Precision Instruments, Inc.501754Общая хирургия
Парафин (TissuePrep)Fisher Scientific8002-74-02
пенициллин-стрептомицинInvitrogen15140-122
ПермаунтFisher ScientificSP15-100
ПГАSigma-AldrichL1668
Свиной желатинSigma-AldrichG6144
ингибитор ROCKCalbiochemY-27632
мыши линии SCID beigeCharles River Laboratories250
Скотт’ПромывкаFisher Scientific6697-32Ricca Chemicals
Пружинные ножницы ВаннасаWorld Precision Instruments, Inc.14003Почечная капсула
β-меркапто–этанолSigma-AldrichM7522

Ссылки

  1. Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  2. Hoof, D. V. an, D'Amour, K. A., German, M. S. Derivation of insulin-producing cells from human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 3, 73-87 (2009).
  3. Li, Z., Han, Z., Wu, J. C. Transplantation of human embryonic stem cell-derived endothelial cells for vascular diseases. J Cell Biochem. 106, 194-194 (2009).
  4. Safinia, N., Minger, S. L. Generation of hepatocytes from human embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 481, 169-180 (2009).
  5. Nury, D., Neri, T., Puceat, M. Human embryonic stem cells and cardiac cell fate. J Cell Physiol. 218, 455-459 (2009).
  6. Cowan, C. A., Klimanskaya, I., McMahon, J., Atienza, J., Witmyer, J., Zucker, J. P., Wang, S., Morton, C. C., McMahon, A. P., Powers, D., Melton, D. A. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med. 350, 1353-1356 (2004).
  7. Schatten, G., Smith, J., Navara, C., Park, J. H., Pedersen, R. Culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 2, 455-463 (2005).
  8. Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
  9. King, F. W., Ritner, C., Liszewski, W., Kwan, H. C., Pedersen, A., Leavitt, A. D., Bernstein, H. S. Subpopulations of human embryonic stem cells with distinct tissue-specific fates can be selected from pluripotent cultures. Stem Cells Dev. 18, 1441-1450 (2009).
  10. Cunha, G. R. Epithelio-mesenchymal interactions in primordial gland structures which become responsive to androgenic stimulation. Anat Rec. 172, 179-195 (1972).
  11. Kirsch, J. H., Klaus, J. A., Blizzard, K. K., Hurn, P. D., Murphy, S. J. Pain evaluation and response to buprenorphine in rats subjected to sham middle cerebral artery occlusion. Contemp Top Lab Anim Sci. 41, 9-14 (2002).
  12. Lee-Parritz, D. Analgesia for rodent experimental surgery. Isr J Vet Med. 62, 74-78 (2007).
  13. Julou, L., Guyonnet, J. C., Ducrot, R., Pasquet, J. Some pharmacological and toxicological studies on ketoprofen. Rheumatol Rehabil. , Suppl 5-10. (1976).

Перепечатки и разрешения

Теги

Анализ формирования тератомыимплантация под капсулу почкимодель иммунодефицитных мышейдифференцировка in vivoиммуногистохимический анализкартирование судьбы зародышевых листковгенетически меченые клеткиприготовление клеточного осадкалектин Phaseolus vulgaris
Судьба картирование человеческих эмбриональных стволовых клеток на формирование тератома
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.