Бактериальный анализ экспрессии генов Использование Microarrays

Protocol

Реакция обратной транскриптазы

Включите нагревательный блок до 70-80 ° С и 42 ° C. Водяные бани также может быть использован в этом шаге. При использовании нагрева блоков, положить немного воды так, чтобы тепло равномерно.

1. Грунтовка реакции
   1. Принимать 3 мкг РНК
   2. Регулировка громкости до 13 мкл водой РНКазы свободный
   3. Добавить 2,5 мкл случайных гексамера праймеров (2mg/mL)
2. Хорошо перемешать и инкубировать при 70-80 ° С в течение 8 минут. Затем поместите на льду в течение 5 мин.
3. Подготовка РТ коктейль (14,5 мкл / Rxn):
   
   

   Ко....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AA-dUTP		Sigma-Aldrich	A0410	5-(3-аминоаллил)-2' дезоксиуридин-5'-трифосфат
dNTP		Amersham	27-2035-01	100 mM dNTP Set PCR grade
Random Hexamer primers		Amersham	27-2166-01	3mg/mL
SuperScript III RT		Invitrogen	80800444	200U/μ L
CyDye™		Amersham	RPN5661	Упаковка реактивных красителей после маркировки
QIAquick		Qiagen	28104	Набор для очистки ПЦР
1 M K2HPO4
1 M KH2PO4
1 M KPO4	Буфер			Чтобы получить 1М фосфатный буфер (KPO4, pH 8,5-8,7) объедините: 9,5 мл 1M K2HPO4 и 0,5 мл 1M KH2PO4
Фосфатный буфер для промывки	Buffer For			100 мл Фосфатный буфер для промывки (5 мМ KPO4, pH 8,0, 80% EtOH) смесь: 0,5 мл 1 М KPO4 pH 8,5 + 15,25 мл MilliQ воды + 84,25 мл 95% этанола. Буфер для промывки будет слегка мутным.** ВАЖНО: Буфер для промывки фосфатами следует готовить ежедневно.
Буфер для элюирования фосфатов	Буфер			разбавления на 1 М KPO4, pH от 8,5 до 4 mM со стерильной водой
Sodium Carbonate Buffer				(Na2CO3): 0,5M, pH 9,0. Растворите 4,2 г NaHCO3 в 80 мл стерильной воды и отрегулируйте pH до 9,0 с 10 Н NaOH; довести объем до 100 мл стерильной водой. Для приготовления 50 мМ раствора для реакции соединения красителя разбавляют водой в соотношении 1:10. Примечание: Карбонатный буфер со временем меняет состав; Делайте его свежим каждые пару недель или месяц.