В этом материале видео и дополнительные, мы показываем протокол для хронических В естественных условиях Визуализации нетронутыми мозга с помощью разбавленной-череп подготовки.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Хронический изображений Мыши зрительной коры Использование тоньше черепа-подготовка
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В естественных изображений с помощью двух-фотонной микроскопии лазерного сканирования (2PLSM) позволяет изучения живых клеток и нейронов процессов в интактном мозге. Техники, представленные здесь позволяет изображений одного и того же область мозга, в нескольких точках времени (хронический изображений) с микроскопическими разрешение позволяет отслеживания дендритных шипиков, которые являются мелкими структурами, которые представляют большинство возбуждающих постсинаптических сайтов в ЦНС. Способность четко решать штраф корковых структур в течение нескольких моментов времени имеет много преимуществ, в частности, в изучении пластичности мозга, в которых морфологические изменения в синапсах и схема реконструкции может помочь объяснить основные механизмы. В этом материале видео и дополнительные, мы показываем протокол для хронических в естественных изображений нетронутыми мозга с помощью разбавленной-череп подготовки. В разреженных черепа препарата минимально инвазивных подход, который позволяет избежать потенциального повреждения твердой мозговой оболочки и / или коры, снижая тем самым начало воспалительного ответа. При этом протокол выполняется правильно, то можно четко отслеживать изменения в характеристики дендритных позвоночника в интактном мозге в течение длительного периода времени.
Протокол
- Для визуализации нейронов в интактном мозге при помощи двух-фотонной микроскопии, подготовка которых нейроны помечены флуоресцентными маркерами используется. В экспериментах, представленные здесь мы используем GFP-М трансгенных мышей линии, которая этикетки слой 5 пирамидальные клетки 1. Уровень 5 пирамидальные клетки проекта дендритные процессы в поверхностных слоях, что позволяет визуализации дендритов и дендритных шипиков на глубину до 300 мкм ниже уровня Пиа. Альтернативный подход заключается в этикетке клеток с использованием вирусных маркеров (см. Лоури и соавт., Представленный на Юпитер).
- Стерилизовать рабочей области, используя 70% этанола и автоклава инструменты для асептической хирургии. Крышка рабочей поверхности чистой повязки.
- Обезболить мышей с Фентанил коктейль (фентанил 0,05 мг / кг, мидазолам 5 мг / кг; metatomadin 0,5 мг / кг), а затем на четверть дозы Avertin (0,0075 мг / мл), используя IACUC утвержденными процедурами. Предварительной обработки мышей с обезболивающим, бупренорфин (0,5 мг / кг) подкожно (SQ). Монитор уровня плоскости анестезии, проверяя реакцию на хвост / ног крайнем случае.
- Поддерживать животных на 37,5 ° С с использованием нагрева одеяло с прикрепленными ректального термометра.
- Применение глазной мази для глаз, чтобы предотвратить глаз от высыхания. Худа глаза с небольшими лист бумаги, чтобы защитить глаза от источника света во время операции.
- Использование ножницы, удалить волосы из задней части головы (за ушами), чтобы глаза.
- Чистая верхней части головы животного с последовательным применением 70% этанола, а затем скраб бетадин и бетадин решение.
- Сделать L-вырезать разрез за ушами и вдоль правой или левой стороны от средней линии (в зависимости от полушария будут в образ), чтобы глаза. Сложите кожу над и далеко от хирургии сайта. Не снимайте кожу, как кожа будет зашивается следующих изображений сессии.
- Использование тонких щипцов осторожно потяните кожу вверх и в сторону от вашей области интересов.
- Аккуратно соскрести надкостницы от пораженном участке черепа чистой щипцов или микрохирургических лезвия. Использование ватным тампоном, нанесите небольшое количество на 10% хлорида железа к черепу, чтобы полностью высохнуть надкостницы мембраны и убедитесь, что она была удалена полностью. Важно, что череп полностью высохнет для обеспечения надлежащего склеивание клеем (см. 11). Использование щипцов или микрохирургические лезвия, осторожно соскрести сухой надкостницы мембраны.
- Нанесите тонкий слой клея цианоакрилат вокруг изображения окна пластиной из нержавеющей стали головой (см. Рисунок 1) и прикрепить пластину к черепу.
- Использование деревянных конце хлопка тампон, палки, нанесите клей на швы внутри изображения окна, убедившись, чтобы заполнить все пробелы между пластиной с изображениями и кривизны черепа.
- Место каплю клея ускорителя в окно. Быстро вытереть избыточного ускоритель клея с помощью ватного тампона или Ким салфеткой. Клей должен быть полностью затвердевших до сверления.
- Начать тонкий череп в изображение окна с помощью бормашины заверенные 0,7 мм из нержавеющей стали заусенцев. Альтернативные бурения с редкими применения 0,9% стерильного физиологического раствора, чтобы избежать создания слишком много тепла, на черепе.
- Тонкие окна 4х4 мм на черепе с помощью небольших ударов по всей поверхности черепа с бормашины. Испытание тонкость череп с тупого конца пинцетом. Поверхности черепа будет отступа немного с легким нажимом. Оптимальная толщина для работы с изображениями черепа составляет от 10 до 30 мкм.
- Когда череп тонкий и окна очистить от всех мусора, место солевой на черепе. Фотографии изображений окно с цифровой камеры, установленной на вскрытии области. Фотография и использование мозга сосудистой поможет в поиске позиции для размещения изображений пластина для последующих сессий визуализации.
- Транспорт животным 2-фотон буровой установки. Животное должно оставаться на обогрев одеяло (с зондом ректальной) в течение всего сеанса визуализации. Обратите внимание: в то время под действием успокоительного, составляющего ядро животного температура будет колебаться значительно, в отсутствие нагревательного элемента в результате повреждения или коры, возможно, смерть.
- Двухфотонного микроскопа с Mai Tai лазер, 10W твердом состоянии насос для максимальной мощности и изменение Olympus Fluoview конфокальной устройство используется. Система оптимизирована для глубокого изображения тканей и внешних детекторов установлены как можно ближе к цели, как можно разрешить максимального обнаружения флуоресценции от мозга. Olympus FL LUMPlan / IR 20X/0.95NA объектива используется. 0,9% физиологического раствора используется во время съемки для целей погружения.
- С помощью этого микроскопа, и низкий цифрового зума (x1) определить области, содержащей ярко меченых нейронов.
- Использование цифровой камеры, прикрепленной к глазу кусок микроскоп, сфотографировать изображение области. Кроме того, обрисовать картину крови сосудов. Это необходимо для повторногосвою очередь, в той же папке изображений с последующей временной точке.
- Получить низким стек увеличением (х20 цели, 512x512 пикселей, 5 мкм, шаг) через весь видимый масштаб мозга (как правило, охватывает около 200 мкм), показывающие степень дендритные ветвления. Примечание: это низкое увеличение изображения будет использоваться для поиска изображений область в последующие моменты времени, как и кровеносные сосуды и дендриты сохранить свою структуру в молодых и взрослых животных.
- Использование для обработки изображений (Fluoview, v. 5.0, FV300), повышение цифровым увеличением в 8 раз. Настройка X, Y координаты (панорамирование координаты) в случае необходимости и собрать высокий стек увеличение, которое покажет подробную дендритных морфологии в том числе мест и структуры дендритных шипиков. Возьмите подробные записи о каждом стеке сбора, то есть кастрюля координаты, диапазон сбора, Z-шаг размер и количество шагов в свой стек. Эти записи будут использоваться при возвращении к этому дендрита или аксона в последующие момент времени.
- После обработки изображений, удалить голову пластину, аккуратно разделяющей пластины от поверхности черепа. Использование щипцов, удалить остатки клея, оставшиеся на черепе и протрите поверхности черепа с 0,9% стерильного физиологического раствора. Шовный кожу над черепом вместе, используя # 6 сшивания потока. Протрите область с 70% этанола. Чтобы облегчить боль во время послеоперационной реабилитации, администрирования 0,1 мг / кг Бупренорфин болеутоляющее, SQ.
- Место животных в чистой клетке под лампой тепло, пока он не проснется и мобилен. Вернуться животное оригинальной клетки.
- Для Reimage животных на более позднем этапе (наши точки изображения времени может быть от 2 дней до нескольких месяцев друг от друга), удалите стежки или возобновить кожу на голове с использованием асептических методов, что и выше. Использование цифрового изображения головного мозга сосудистой (взято на первом свидании хирургии), чтобы найти исходное расположение изображения. Reaffix нержавеющей стали headplate (шаги 10-12). Использование микрохирургической лезвием аккуратно тонкую далеко любые кости, которые могли быть повторно вырос между точками изображения времени. В случае необходимости, с тонкими бормашины. Прозрачное окно изображения от мусора и применять капли 0,9% стерильного физиологического раствора.
- Carry животное двухфотонного микроскопа и найти исходное поле изображения. Использование цифровой фотографии, сделанной во время первой сессии изображений для получения помощи.
- Открытое Fluoview программу и открыть исходный низкий увеличения изображения. Прикрепите прозрачности листа на экран компьютера и эскиз картины основных кровеносных сосудов использованием прозрачности пера.
- Открытое Изображение в реальном времени и перестроить крови к сосудистой набросал рисунок на прозрачной пленке.
- Для Reimage 8x увеличено структур, откройте желаемый собраны стек от предыдущей сессии изображений. Очерк структуры (т.е. аксонального, дендритные, глиальные) на прозрачной пленке, прикрепленной к экрану компьютера.
- Увеличить 8x от живого изображения и установить кастрюлю координаты первые параметры визуализации день. В зависимости от точности выравнивания низкое расположение увеличение, это может быть необходимо также отрегулировать угол изображения незначительно. Как только желаемую структуру найден, совпадают структуру вашего рисовал картины высоких увеличениях. Сбор Z-Stack с одинаковым размером шага и номер Z-Stack изображения для последующего анализа.
- Повторите шаги 29 и 30, пока все изображения с высоким увеличением повторно собираются.
- При визуализации завершена, повторите шаги 22-24. Re-изображений может быть повторен на скорости до 2 отдельные моменты времени.
- Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными Виварий и отдела лабораторных животных медицины Университета Рочестера школы медицины и стоматологии, в полной аккредитации Ассоциации оценке и аккредитации лаборатории по Уходу за животными, International (AAALAC) и в соответствии с государственным законом, федеральным законом и NIH политики.
Представитель Результаты
В GFP-М выразив мышей, подмножество слоя 5 пирамидальные клетки и соответствующие дендритные процессы могут быть легко визуализированы с помощью 2-фотонный лазерной сканирующей микроскопии (2PLSM) 1. Здесь мы показали в разреженных черепа подготовки, в которой череп желаемое расположение изображений сокращается до ~ 10-30 мкм. Выполнены правильно, наш протокол позволил четко визуализировать корковых дендритов и шипы в интактном зрительную кору острой или хронической анализа (рис. 2).
Рисунок 1. Custom голова и опорной плиты. () Вид сверху на заказ голова и основание для разреженных черепа операции подготовки. (B) Вид сбоку на заказ голову и опорной плиты. (C, D) Подробные схемы и изображение головы пластинку.
в естественных условиях в зрительной коре трансгенных GFP-М мыши с помощью двух-фотонной микроскопии. Изображение является проекцией одного изображения, полученного через каждые 5 мкм от мягкой до конечной глубине 175 мкм. Коробках область в увеличенном представляет регион в (Б) и (С) отображается на день 0 (D0) и четыре дня спустя (D4). (D, E) Высшее увеличение дендритные ветви загнала вас в угол В и С демонстрируют стабильный шипами (белые наконечники стрел), потеряли / сворачивания шипами (красный наконечники стрел) и новые шипы (руководители зеленая стрелка). Шкала баров = А. 200 мкм, B, C. 20 мкм, D, Е. 5 мкм.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Хронический визуализации с использованием двухфотонного микроскопии становится все более популярной техникой для изучения морфологических изменений, вызванных в течение 2-5 пластичности. Здесь мы показываем, в разреженных черепа подготовки следовать определены дендритных шипиков в интактном мозге мышей в разные дни изображений. В этом протоколе черепа остается без изменений, что приводит к минимальным повреждением мозга и приводит к очень низким уровням neuroinflammation которые могут изменить функцию мозга <...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Эта работа была поддержана Burroughs Wellcome Карьера премии в области медико-биологических наук (АКМ), Уайтхолл исследовательского фонда Грант (АКМ), Слоан стипендии Фонда (АКМ), NIH EY019277 (АКМ) и НОУ финансируется, Видение Обучение Грант, EY013319 ( ЕАК).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии | |
|---|---|---|---|---|
| Фентанила цитрат | Внутри учреждения | Коктейль с фентанилом: анестезирующий коктейль; Доза при внутрибрюшинном введении: 0,0125 мл/г Конц. итогового коктейля: 0,05 мг/кг | ||
| Медетомидина гидрохлорид | Внутри лаборатории | Коктейль с фентанилом: анестезирующий коктейль; Доза при внутрибрюшинном введении: 0,0125 мл/г Конц. итогового коктейля: 0,05 мг/кг | ||
| Мидазолама гидрохлорид | Внутреннее производство | Коктейль с фентанилом: анестезирующий коктейль; Доза при внутрибрюшинном введении: 0,0125 мл/г<Визуализация in vivo с помощью двухфотонной лазерной сканирующей микроскопии (2PLSM) позволяет изучать живые клетки и нейронные структуры в неповрежденном мозге. Представленный здесь метод позволяет проводить визуализацию одной и той же области мозга в разные моменты времени (хроническая визуализация) с микроскопическим разрешением, позволяющим отслеживать дендритные шипики — небольшие структуры, которые составляют большинство постсинаптических возбуждающих сайтов в ЦНС. Возможность четко различать тонкие структуры коры в течение нескольких временных точек имеет множество преимуществ, особенно при изучении пластичности мозга, где морфологические изменения синапсов и перестройка цепей могут помочь объяснить лежащие в их основе механизмы. В данном видео и дополнительных материалах мы представляем протокол хронической визуализации in vivo неповрежденного мозга с использованием метода истончения черепа. Метод истончения черепа является минимально инвазивным подходом, который позволяет избежать потенциального повреждения твердой мозговой оболочки и/или коры, тем самым снижая риск возникновения воспалительной реакции. При правильном выполнении данного протокола становится возможным четко отслеживать изменения характеристик дендритных шипиков в неповрежденном мозге в течение длительного периода времени.> Финальная конц. коктейля: 0,05 мг/кг | ||
| 2,2,2-трибром–этанол | Коктейль с авертином: анестетик; Доза при внутрибрюшинном введении: 0,0075 мл/г Финальная конц. коктейля: 1% | |||
| 2-метил-2-бутанол (конечная концентрация: 0,775%) | Коктейль из авертина: анестетик; Доза при внутрибрюшинном введении: 0,0075 мл/г Финальная конц. коктейля: 0,775% | |||
| Система температурного контроля TC-1000 для мышей | CWE, Inc. | Мышь TC-1000 | Регулирование температуры тела | |
| Тоберадекс | Внутренний (собственной разработки) | Глазная мазь | ||
| 10% хлорид железа (III) | Ricca Chemical Company | 3120-32 | Подготовка препарата с истончением черепа | |
| Микрохирургический скальпель | Sable Industries | S-6400 | Метод истончения черепа | |
| Цианакрилат 404, 401 | Loctite | Артикул 46551 | Подготовка препарата с истонченным черепом | |
| Цианоакрилат 401 | Loctite | Кат. № 40140 | Метод истончения черепа | |
| Ускоритель клея Zip Kicker | Технология Pacer | PT-29 | Метод истончения черепа | |
| Микродрель, стальные боры, диаметр наконечника 0,7 мм | Fine Science Tools | 19008-07 | Подготовка препарата с истонченным черепом | |
| Блок управления микрокрутящим моментом и наконечник Tech2000 | Ram Products, Inc. | TECH2000 ВКЛ/ВЫКЛ | Метод истончения кости черепа | |
| шелковая шовная нить 6-0 (0,7 мм) | Ethicon Inc. | K8894H | Конус C-1 | |
| Пинцет глазной, 10 см, ширина кончика 0,5 мм, изогнутый | Хирургические инструменты | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Сверхтонкие ножницы Bonn, 8,5 см, прямые кончики, режущая кромка 13 мм | Хирургические инструменты | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Стандартный анатомический пинцет, прямой, размер кончика 2,5 мм x 1,35 мм, длина 12 см | Хирургические инструменты | Fine Science Tools | 11000-12 |
Ссылки
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Holtmaat, A. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Majewska, A. K., Newton, J. R., Sur, M. Remodeling of synaptic structure in sensory cortical areas in vivo. J Neurosci. 26 (11), 3021-3029 (2006).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. J Vis Exp. , (2008).
- Yang, G. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
- Xu, H. T. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
