Методическая статья
Pseudofracture, воспроизводимые мышиной модели стерильной опорно-двигательного аппарата травмы, позволяет для оценки позднем сроке посттравматического иммунного ответа. В этой статье описываются процедурные исполнения модели шаг за шагом, в том числе потенциал для экспериментальных комбинаций модель позволяет изучать множественные травмы.
После травмы есть рано гипер-реактивной воспалительной реакции, что может привести к полиорганной недостаточности и высокой смертности в травматологических больных; этот ответ часто сопровождается задержкой иммуносупрессии, которая добавляет клинических осложнений инфекции и может также увеличить смертность 1-9. Многие исследования приступили к оценке этих изменений в реактивности иммунной системы после травмы. 10-15
Иммунологические исследования сильно поддерживается посредством разнообразных трансгенных и нокаутных мышей доступны для прижизненного моделирования;. Этими штаммами помощи в детальных исследований для оценки молекулярных путей, участвующих в иммунологических реакций 16-21
Задача в экспериментальных мышиных моделирования травма долгосрочного расследования, а перелом фиксация методы у мышей, могут быть сложными и не так легко воспроизводимым. 22-30
Это pseudofracture модели, легко воспроизводится модель травмы, преодолевает эти трудности, иммунологически имитирует среду конечностей перелома, позволяя при этом свободу передвижения животных и долгое выживание срок без постоянного, длительного применения анестезии. Намерение воссоздать особенности долгое перелом кости; ранения мышцы и мягкие ткани подвергаются поврежденные кости и костный мозг, не нарушая родной кости.
Pseudofracture модель состоит из двух частей: двусторонние травмы раздавить мышцы задних конечностей, после инъекции раствора в кости эти ранения мышц. Кости раствор готовят уборки длинных трубчатых костей с обеих задних конечностей от возраста и веса соответствием сингенных донора. Эти кости затем измельчают и ресуспендировали в фосфатном буферном растворе для создания костной решение.
Двусторонний перелом бедренной кости является широко используемым и хорошо налаженные модель конечностей травмы, и была сравнительная модель при разработке pseudofracture модели. Среди множества доступных моделей перелома, мы решили использовать закрытым способом разрушения с мягкими повреждения тканей, как наши сравнению с pseudofracture, как мы хотели стерильной еще пропорционально тяжелой периферической модели травмы тканей 31.
Геморрагический шок является частая находка в условиях тяжелой травмы, и глобальные гипоперфузии добавляет очень актуальна элемент травмы модели. 32-36 pseudofracture модель может быть легко сочетается с геморрагическим шоком для модели модели множественной травмы высокой вредоносности 37.
1. Инструмент и Хирургическая подготовка поля:
Все экспериментальные процедуры проводятся с использованием асептических методов. Перед началом работы экспериментальной площадки должны быть тщательно очищены и стерилизованы. Настольный следует дезинфицировать, позволил высохнуть на воздухе, а затем протереть 70% спиртом. Место хирургического синий блокнот и стерильные перевязочного в опытном участке работы.
Все материалы и инструменты автоклаве стерилизовать перед использованием. Шприцы и иглы получили стерильные. Исследователь должен быть соответствующим образом одет в халат, хирургические маски и стерильные хирургические перчатки.
Наши хирургические инструменты автоклаве стерилизовать каждый вечер. Они моют после операции с применением антибактериального мыла и воды. Им разрешается сушить на чистую хирургических синие панели. Затем они осторожно положил в карман стерилизации и стерилизовать для дальнейшего использования.
Включите горячую бусинка стерилизатор для обеспечения не достигнет нужной температуры - 300-350 ° F до начала эксперимента. Этот стерилизатор будет использоваться для очистки инструментов экспериментальных процедур соответствующих мышей. Получить из нержавеющей стали лоток инструмент и залейте его 1 / 3 часть пути с 70% этанола. Там должно быть достаточно 70% этанола, чтобы покрыть ваши хирургических инструментов. Включите циркулирующих грелку и место хирургического синий площадку над ним, а затем стерильной перевязочного на вершине этого. Эта каменка используется для обеспечения адекватного тепло мыши во время эксперимента и периода восстановления. Поместите все стерильные инструменты, марля, шприцы, иглы и 1,5 мл трубки микроцентрифужную на стерильную повязку области. Будьте осторожны при открытии любого стерильные инструменты и другие предметы, не загрязнять их, прикасаясь к ним. Лучше всего использовать стерильные перчатки при этом процедуру установки.
2. Pseudofracture Модель - экспериментальной процедуры:
1. Индукция анестезии и позиционирования мыши.
Начните путем введения при введении препарата в Pentobarbitol (70mg/kg). Это достигается за счет первого подъема мыши из клетки использованием проксимальный конец его хвоста. Мышь должна быть весил рассчитать правильную дозировку anaesthesic. Далее, поместите животное в верхней части клетки, продолжая удерживать ее хвост. Захватите шиворот мыши с большим и средним пальцами по обе стороны от мыши сразу за передними лапами. Указательный палец используется для потяните кожу на голове / шее области спины и частично обездвижить голову. Хвост мыши проходит между мизинцем и безымянным пальцем в то время как безымянный палец вдавливается в поясничном отделе позвоночника мыши. Анестезии должны в полной мере в силу в течение примерно 5 минут, и должны быть подтверждены рефлекс испытания.
После животное спит, наведите в положении лежа на борту плексигласа и использовать свободную технику ленты петля для иммобилизации их запись на пленку их конечностей. Свободную технику цикл просто влечет за собой резки тонких полос ленты и упаковки ленты свободно вокруг дистальной части каждой конечности. Лента то застрял обратно к себе и оставшиеся ленты крепится к доске. Это позволяет экспериментальных манипуляций, выполняемых на постоянной основе, а также обеспечение конечностей мышей на себя более естественном положении. Брюшные, паховые, и бедра регионов животного затем бритая используя наш Остер A5 ножницы (размер 40 лезвия), чтобы помочь поддерживать стерильную области. Марли 4х4 облили бетадин и хирургической области, затем вытер стерилизовать. Стерильную повязку поле затем сложить и задрапированные через мышь, чтобы воздействие только нижних конечностей и головы.
После блокировки и стерилизации, место носового конуса с изофлуран над носом мыши в течение нескольких секунд перед началом эксперимента. Носового конуса состоит из 50cc конической трубки, заполненной марлю. Половина нижний конец трубки вырезают создание пространства для носа мыши, чтобы вписаться в. Колпачок (нижней части контейнера хранения ткани т.е. прямой стороной широкий сосуд рот) помещается на обрезанный конец конической обеспечить изофлуран пары остаются в трубку, когда он не используется. Один мл изофлуран должны быть добавлены к марли в конус. Тщательное внимание должно быть уделено использованию мыши во время анестезии и в частности, использование изофлуран через носовой обтекатель. Как только дыхание животного начинают медленно, эксперимент может начаться, и носовой обтекатель должны быть удалены и закрыты.
Если дополнительные анестезии требуется течение какого-либо части эксперимента, дополнительные пентобарбитал может быть введен или изофлуран ведении. Альтернативные методы управления isofluorane имеются в наличии и обновленные руководящие принципы Рекомендованныйпрекратить использование точностью испаритель, чтобы лучше контролировать анестезии, если это возможно. Тем не менее, пристальное внимание к дыхательной физиологии мыши должны быть гарантированы с любым из этих методов.
2. Pseudofracture эксперимента.
Псевдо-перелома сочетание мягких травм ткани с последующим костного инъекционного раствора потерпевшей мышцы и осуществляется на двусторонней основе для задних конечностей. Кости решения должны быть готовы до того, экспериментальные манипуляции получателя мышей начинается.
3. Кость приготовления раствора.
Кость раствора, приготовленного из одного донора мыши будет достаточно для 3 мышей получателя. Сингенных мыши доноров следует использовать, что зависит от возраста и веса соответствием получателю экспериментальной мыши.
Донорами мышь будет эвтаназии ингаляционными изофлуран. Доноров будет тогда, приклеенный к доске с плексигласа пристальное внимание на ленту нижних конечностей только на кончике ноги. Нижних конечностей должны быть тщательно выбритый и полностью покрыты бетадин, а затем протирают спиртом на стерильность. Затем бедра и голени будет удалена хирургическим путем в стерильных образом с обеих нижних конечностей. Чтобы удалить из длинных костей нижних конечностей, делать хирургический разрез в коже в паховой области, и продолжают резать кожу по всей длине конечностей, вплоть до лодыжки. Уберите кожи, и вскрыть его от подкожной фасции и мышцы, как на средние и боковые аспекты для максимального воздействия. Вставьте один лезвие ножниц под мышцы, которые находятся передние и боковые для голени (передней большеберцовой, разгибателей пальцев Лонга, разгибателей Лонга hallicus, малоберцовой мышцы, малоберцовой мышцы) и сдвиньте лезвие проксимально и дистально поднять мышцы чисто от основной кости. Повторите эту технику на задней и медиальной нижней голени отделить мышц под голени (икроножная, камбаловидной, подошвенной, большеберцовой задний, сгибателей пальцев Лонга, сгибателей hallicus Лонга). Минимальные дополнительные напряжения должны быть использованы на задней стороне, когда скользящая дистально, для того, чтобы хватать малоберцовой кости от голени. На проксимальном конце этих мышц ног сократить сухожилия как можно ближе к их вставками это возможно, и отказаться мышцы дистально, а потянув за мышечную группу вместе в моде вниз небольшой буксир выпустит дистального прикрепления этих мышц от голеностопного сустава. Голеностопного сустава можно прорезать непосредственно с ножницами. Не отсоединяйте голени от бедра в этот момент! Это соединение дает дополнительные рычаги, которые помогут в рассечении бедренной кости от тазобедренного сустава. Следуйте подобную технику для выпуска мышцы бедра и выполнения этой сзади, и оба медиально и латерально также в случае необходимости. Вырезать дистального прикрепления этих групп мышц, чтобы освободить их от коленного сустава. Продолжить рассечение и следовать под мышцы рассекают конца бедренной кости из тазобедренного сустава. Чтобы помочь в этом рассечение, разрез кожи должна быть расширена по мере необходимости в целях обеспечения адекватного воздействия. Движение бедра в тазобедренном суставе может помочь найти проксимального конца бедренной кости во время вскрытия.
Как только бедра (с голени прилагается) удаляется из доноров мыши разместить их на стерильной 4x4gauze. Две кости могут быть разделены на коленный сустав просто схватив каждой кости в отдельном руку и мягко скручивания / вращающийся две кости в противоположных направлениях вдоль длинной оси. Нежный вскрытия и обработки этих двух костей рекомендуется, поскольку они могут быть легко сломана с любым перенапряжения из ручного манипулирования. Для удаления оставшегося вложения сухожилия из длинных костей, используйте сухую стерильную кусок марли 4х4 обернутые вокруг длину кости. Возьмите эту марлю плотно к кости вытащить его на всю длину кости несколько раз, это будет скрести остальных тканей с поверхности кости, как они будут придерживаться марли и быть быстро и легко оторвалась от кости. Собрал кости должны быть размещены непосредственно в стерильный 1,5 мл трубки микроцентрифужную и помещают на лед на транспорте.
Эти четыре кости доноров будут приняты меры по биологической безопасности кабинета для подготовки к кости решение. Капот должны быть тщательно дезинфицировать перед использованием, место стерильную повязку поверх поля рабочего места в капюшон. Место стерильной ступку и пестик, стерильные 8ml трубки и стерильный фосфатно-солевым буфером (PBS) в рабочей зоне. 1 мл pipetteman и соответствующих советов должны быть доступны в капюшон.
Стерильные пара щипцов должна быть использована для удаления собранных костей в стерильных моды из 1,5 мл трубки микроцентрифужную и помещают в раствор; пестик будет использоваться, чтобы мягко давить кости. Phosphел солевой буфер является транспортное средство, используемое для ресуспендирования костных фрагментов для инъекций. Внесите 1 мл ФСБ в раствор и продолжать давить оставшиеся фрагменты, с дополнительными круговыми движениями по обеспечению полного ресуспендирования. Затем добавить еще 1 мл ФСБ и продолжить дробление для создания "кости решение». Решение должно иметь розовый оттенок, и не будет остатки налево на нижней части раствора, который не может быть полностью разрушена. Медленно влить раствор из раствора в 8 мл трубку, чтобы поймать максимальной громкости, обеспечивая при этом большую остатки остаться в ступке. Эта кость решения должны оставаться на льду до его экспериментального использования и будут переведены на 1 мл шприцы для инъекций. Двадцать иглы будет позже прикреплены к 1 мл шприц, содержащий кости решение для того, чтобы управлять его мышью. Это большой размер иглы был выбран, чтобы гарантировать, что все фрагменты костей войти в регион при инъекции и не блокируют иглу.
Перед инъекцией получателю мыши, капля кость раствора помещают на тарелку МакКонки агар для культуры (инкубации в течение 24-48hours). Это необходимо для обеспечения стерильности кости решение. РН кости решения также должны быть проверены, чтобы обеспечить нейтральный рН.
4. Мягкие повреждение тканей.
Этот мягкий повреждение тканей является двусторонним травмы раздавить задних конечностей. Начальное позиционирование мыши, с задних конечностей слегка похищены, а по бокам вращается, помогает в доступности нужную группу мышц, сгибатели колена (бицепс бедра, полусухожильной и полуперепончатой мышц). Большой 18см кровоостанавливающего будет использоваться для выполнения раздавить травм. Распределение силы этих hemostats применяться были проанализированы и признаны 270psi использованием Topaq системного анализа давления на датчик Продактс Инк кровоостанавливающего должна быть прикреплена вокруг задних мышц бедра, вдоль середины бедра, с ее выпуклую кривую, стоящих перед бедра. Кровоостанавливающего должны быть заблокированы закрыты до первого щелчка только и сохраняться в течение 30 секунд. Пристальное внимание к размещению этого кровоостанавливающего важна - она не должна быть прикреплена на бедро, чтобы убедиться, что это не перелом. Это должно быть выполнено в согласованном порядке каждый раз, чтобы гарантировать воспроизводимые травмы между мышами. Это размозжение проводится на обеих нижних конечностях.
5. Кость инъекции раствора.
Получатель экспериментальной мыши будет под наркозом и подготовлены, как описано выше, и прошли мягкой повреждение тканей до этого кости инъекции.
Кости решение затем будет введен в измельченных мускулатуры бедра получателя мыши на двусторонней основе. Использование 20 калибра иглы, 0.15mL этого решения будет выведена на задней мышцы бедра каждого. Введите иглу через кожу примерно на 2 ~ 3 мм и обратить внимание на расстояние введения иглы - вы будете чувствовать себя, как кончик скос не коснется против бедра, это положение является идеальным. Inject кости решение сейчас. Снять иглу и быстро разместить стерильных перчатках пальцем месте инъекции, чтобы остановить любой обратный поток кости решение из раны. Задержитесь в этом палец там в течение нескольких секунд.
Мыши затем будут помещены обратно в клетку и будет предоставлена полная свобода движения непосредственно в качестве субсидий анестезии. Соответствующее управление боли должны быть введены в виде мыши пробуждается.
6. Post-operative/recovery период.
Свободные ленты петля снимается и животных помещают в чистую клетку, которая хранится на циркулирующие грелку в течение нескольких часов после восстановления. Соответствующие тепло должно быть обеспечено с дополнительной лампой тепло, если требуется.
Пища и вода будут легко доступны.
Болеутоляющие должны быть введены в виде животных начинают просыпаться от наркоза, чтобы правильно управлять болью. Бупренорфин (0.1mg/kg) вводится подкожно, как животные начинают физической активности, но не раньше, чтобы не идти на компромисс дыхательной функции.
Мыши должны находиться под постоянным контролем во время анестезии, до выздоровления от наркоза или экспериментальные точки. Мыши должны быть очень тщательно контролироваться в послеоперационный период и любые дополнительные обезболивающее необходимо следует вводить по мере необходимости. Монитор животных физической активности, дыхательных статуса, питания и водозабора и какие-либо признаки дистресса (затрудненное дыхание, боль, изменения в еде и питье привычки) должны решаться соответствующим образом.
Наведите хирургические инструменты в 70% спирте и протрите им стерильную марлю затем положить их в Microbead стерилизатор для ~ 20 секунд для стерилизации между животными. Удалить хирургических инструментов и брызги их с 70% спиртом, чтобы помочь им остыть. Разместите их на улerile перевязочного. Убедитесь, что нет никакого алкоголя осталось на инструменты, которые будут капать обратно в следующем животных.
3. Сравнительный Двусторонние Модель разрушения бедренной кости - Экспериментальные процедуры:
Экспериментальные мыши будет под наркозом и подготовлены, как первоначально описано. Большой 18см кровоостанавливающего должна быть прикреплена вокруг задних конечностей примерно 2-3мм выше коленного сустава с ее выпуклой поверхности, обращенной колена. Поместите большой палец сверху зажаты кровоостанавливающего и указательный палец между кровоостанавливающего и бедро. Будьте уверены, чтобы чувствовать себя бедра до скручивания, чтобы вы знали, где вы нарушаете. Затем поворот против часовой стрелки при кровоостанавливающего крутящий другой рукой по часовой стрелке.
Повторите процедуру с контралатеральной ноги.
4. Несколько моделей Травма - Экспериментальная Процедура Сочетание Pseudofracture с Геморрагический шок:
Получатель мышь будет под наркозом и подготовлены, как первоначально описано. Мыши, которые должны пройти геморрагического шока в сочетании с псевдо-перелом бедра будет катетеризация артерии до pseudofracture процедуры, а затем будет растратил из этого катетер раз псевдо-перелом был завершен.
5. Секреты успеха:
Общие сведения:
Подготовка костей решение:
Мягкие повреждения тканей:
Инъекции Кость решение:
6. Послеоперационные проблемы:
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Pseudofracture, воспроизводимые мышиной модели стерильной опорно-двигательного аппарата травмы, позволяет для оценки посттравматического иммунного ответа. Pseudofracture модель иммунологически имитирует среду конечностей перелома через воссоздание особенностей долго перелома кости: ранения мышцы и мягкие ткани подвергаются поврежденные кости и костный мозг, не ломая кости родной 38,39 двухфазный иммунный ответ можно увидеть следующее. pseudofracture травму, которая состоит из ранней hyperinflammatory ответ, к...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными Институциональные уходу и использованию животных комитета и проведения научных исследований и соблюдения правил из Университета Питтсбурга, AALAS / AAALAC аккредитованном учебном заведении. Животные источники включают Джексон Лаборатории и Чарльз Реки Laboratories. Все животные проходят обширные гарантии здоровья с помощью каждого поставщика, а также университета внутренних программ Питсбурга здоровья животных мониторинга. Это исследование проводилось в соответствии с американским правительством принципы для использования позвоночных животных. Программа зарегистрирована в Министерство сельского хозяйства США, и имеет гарантию письмо с общественностью Управления Службы здравоохранения защиты животных лаборатории.
Источник финансирования / Число молекулярной биологии геморрагического шока GM053789
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Хирургическая синяя прокладка | Fisher Scientific | 50-7105 | |
| Стерильные полевые повязки | Fisher Scientific | NC9517505 | |
| Циркуляционная грелка 18"x26" | Harvard Apparatus | py872-5272 | |
| Стерилизатор инструментов с горячими шариками | VWR international | 11156-002 | |
| Лоток из нержавеющей стали 8" x 11" | VWR international | 62687-049 | |
| Плиты из плексигласа (10x15x0.5см) | Университет Питтсбурга Машинный цех | ||
| Рулоны ленты 1" | Corporate Express | MMM26001 | |
| 50cc коническая труба | Любой поставщик | ||
| Банки с широким горлышком с прямой стороны (используются в качестве крышки для носового обтекателя) | VWR international | 159000-058 | |
| Oster A5 Ножницы для стрижки с размером 40 лезвий | VWR international | 10749-020 | |
| Хирургические ножницы (прямые – 12см) | Инструменты для тонкой науки | 14068-12 | |
| Гемостатики изогнутые -18см | 81331718 | ||
| щипцами Гарвард (наконечник 0,8мм, изогнутый-10см) | Инструменты для тонкой науки | 11050-10 | |
| Марля 4"x4 | "Любой поставщик | ||
| Трубка для микрофуги объемом 1,5 мл | Любой поставщик | ||
| Ведро для льда | Любой поставщик | ||
| Ступка и пестик | Fisher Scientific | 12-961AA | |
| Шприц 1cc с иглой 25G Fisher | Scientific | 14-826-88 | |
| Игла 20G Любой | поставщик | ||
| 1 мл пипетщик | Любой поставщик | ||
| Наконечники для пипеток 1 мл | Любой поставщик | ||
| Falcon полистирольные трубки 8 мл | VWR international | 60819-331 | |
| Стерилизационный пакет 3"x8" | VWR international | 24008 | |
| Стерилизационный пакет 5"x10" | VWR international | 24010 | |
| MacConkey II Agar plate | BD Biosciences | 221172 | |
| Этиловый спирт - 200 пробы | Pharmco-AAPER[ | 70%] | |
| Пентобарбитал натрия (раствор натрия нембутола) | OVATION Pharmaceuticals | 70 мг/кг | |
| Аерран (изофлуран) | Baxter Internationl Inc. | 99,9% | |
| Триадин Повидон Йод (Бетадин) | Одноразовые триады | ||
| Фосфатный буферный раствор (PBS) | |||
| Бупренорфин гидрохлорид | Bedford Laboratories | 0,1 мг/кг |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE
Запросить разрешение