Факторов клетки-хозяина играет важную роль в установлении и поддержании саркома Капоши (СК). Мы выделяем методы выявления факторов клетки-хозяина изменены KSHV-инфицированных DMVEC клеток, и в ткани опухоли KS. Сотовая гены изменены вирус будет служить потенциальной мишенью (ы) для терапии романа.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Определение дизрегуляции Гены индуцированные саркомы связанных герпеса Капоши (KSHV)
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В настоящее время КС является наиболее преобладающим вопросам ВИЧ / СПИДа злокачественности в Южной Африке и, следовательно, мира. 1,2 Он характеризуется как angioproliferative опухоли сосудистых эндотелиальных клеток и производит редкие ячейки B лимфопролиферативных заболеваний в виде плеврального выпота лимфомы (PEL) и некоторые формы болезни многоцентровое Кастельмана. 3-5 Только 1-5% клеток в KS поражения активно поддерживать литической репликации саркомой Капоши связанные герпеса (KSHV), этиологическим агентом связанные с КС, и ясно, что клеточные факторы должны взаимодействовать с вирусными факторами в процессе онкогенеза и опухолевой прогрессии. 6,7 Выявление новых хост-фактора детерминанты, которые способствуют KS патологии имеет важное значение для разработки прогностических маркеров для прогрессирования опухоли и метастазов, а также для разработки новых терапевтических средств для лечения KS 8. сопровождающих детали видео методы мы используем, чтобы идентифицировать клетки-хозяина экспрессии генов программ изменены в кожных капилляров эндотелиальные клетки (DMVEC) после заражения KSHV и в опухолевой ткани KS. 9 После дизрегуляции генов идентифицированы с помощью анализа микрочипов, изменения в экспрессии белка являются подтверждается иммуноблота и двойной помечены иммунофлюоресценции. Изменения в экспрессии транскрипционных генов дизрегуляции подтверждены в пробирке количественными реальном времени полимеразной цепной реакции (QRT-PCR). Проверка в пробирке результаты, используя архивные опухоли KS ткани, проводится методом двойной помечены иммунохимии и тканей микрочипов. 8,10 Наш подход к определению дизрегуляции генов в ткани опухоли микроокружения KS позволит развития в пробирке, а затем в естественных условиях модельных систем для обнаружение и оценка потенциальных терапевтических роман для лечения КС.
Протокол
1. KSVH Выращивание и Заражение DMVEC
- BCBL-1 клеточная линия, первоначально выделенные из человеческого тела полости основаны лимфома, культивируют в полной RPMI 1640 средств массовой информации (Gibco, Grand Island, NY). BCBL-1 клетки удаляются из жидкого азота, перевозимых на сухой лед, и быстро талых в течение 1 минуты при температуре 37 ° C. 50 мкл BCBL-1 клеток при плотности 1х10 4 клеток / мл добавляют 500 мл RPMI 1640 среде с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1x пенициллина / стрептомицина и распространяется в 175 колб см, при 50 мл / флакон .
- Колбы BCBL-1 Затем клетки инкубировали при 37 ° С в атмосфере 5% CO 2, ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Методологий, используемых в этом отчете могут быть выполнены в различных лабораторных условиях. Они требуют специального оборудования или доступ к основным объектов. Надлежащие меры предосторожности должны быть приняты при выполнении экспериментов инфекционных вирусных патогенов, как KSHV, которые могут потребовать использования уровня biosaftey 3 (BSL-3) объекты. Ткань приобретений также должны быть утверждены соответствующие институциональные наблюдательные советы (IRBs).
Эти методологии в.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Мы благодарим Джеймса К. Хилдрет, Мехарри медицинский колледж, за его советы и обзор этой рукописи. Мы также благодарим Диана Marver для редактирования рукописи. Эта работа была поддержана Мехарри Вандербильта Центр исследований СПИДа (NIH грант P30 AI054999-05); Центра исследований СПИДа неравенствам в отношении здоровья, NIH грант 5U54 RR019192-05; Мехарри Центра клинических исследований, грант NIH P20RR011792, а к NIH грант P01 CA113239. DJA частично финансировалась пилот гранты от Вандербильт-Мехарри Центра исследований СПИДа (CFAR) и Мехарри Центра клинических исследований (КПР).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Invitrogen | 05-0001DJ | |
| TPA | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| PBS pH 7.4 | Invitrogen | 10010-023 | |
| Бутират натрия | Sigma-Aldrich | 19364 (FLUKA) | |
| Среда EBM-2 | Lonza Inc. | CC-3156 | + добавка из набора bullet kits |
| Клетки DMVEC (HMVEC) | Lonza Inc. | CC2543 | |
| Фекальная сыворотка теленка | Hyclone | SH30066.03 | |
| Пенициллин/стрептомицин | Invitrogen | 15140-122 | |
| Камерные стекла | Nalge Nunc international | 154461 | |
| МАТ к KSHV LANA | Vector Laboratories | VP-H913 | разведение 1:50/ИФА |
| поликлональные АТ к Galectin-3 (коза) | R&D Systems | AF1154 | |
| FITC-конъюгат анти-козьих АТ (осел) | Jackson ImmunoResearch | 705-095-1 | |
| Rho-конъюгат анти-козьих АТ (осел) | Jackson ImmunoResearch | 705-295-003 | разведение 1:100/ИФА |
| Среда для заключения препаратов | Vector Laboratories | H 1500 | Vectashield с DAPI |
| Набор для определения концентрации белка BCA | Pierce, Thermo Scientific | 23235 | |
| Нитроцеллюлоза | Bio-Rad | 161-0112 | |
| Конъюгат анти-козьих АТ (осел) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC 2020 | |
| Субстрат для вестерн-блоттинга | Pierce, Thermo Scientific | 34075 | |
| Биотинилированные кроличьи анти-козьи АТ | Dako | 305-065-045 | |
| Конъюгат АЩ-стрептавидин | Dako | K 0492 (набор) | |
| Набор для удаления РНКаз и ДНКаз | Qiagen | 79254 | |
| Циклер MJ Mini Cycler | Bio-Rad | PTC-1148C | |
| Биофотометр | Eppendorf | 952000006 | |
| Центрифуга RC 6 Plus | Sorvall, Thermo Scientific | 46910 | |
| Ультрацентрифуга Coulter Optima L-90K | Beckman Coulter Inc. | 392052 | |
| Система детекции ПЦР в реальном времени MYiQ iCycler | Bio-Rad | 170-9770 | |
| Флуоресцентный микроскоп TE 2000S | Nikon Instruments | TE2000S | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | G2938C | |
| Eclipse E 200 | Nikon Instruments | E 200 | |
| Центрифуга Sorvall Legend RT | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 75004377 |
Ссылки
- Sitas, F., Newton, R. Kaposi's sarcoma in South Africa. J Natl Cancer Inst Monogr. 28, 1-4 (2001).
- Moore, P. S., Chang, Y. Kaposi's sarcoma associated herpesvirus. Field's Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams and Wilkins. Philadelphia, PA. 2803-2833 (2002).
- Chang, Y., Cesarman, E., Pessin, M. S., Lee, F., Culpepper, J.....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
