С целью изучения экспрессии генов в ткани куколки крыло Bicyclus anynana, мы представляем оптимизированный протокол на месте гибридизации использованием riboprobes. Мы также предоставляем рекомендации по дальнейшей оптимизации этого протокола для использования в куколки крылья других видов чешуекрылых.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В месте Протокол крылья бабочки куколки Использование Riboprobes
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Здесь мы представляем, в видео-формат, протокол на месте гибридизации в куколки крылья бабочки Bicyclus anynana использованием riboprobes. В месте гибридизации, основой биологии развития, являются полезными для изучения пространственных и временных паттернов экспрессии генов в развивающихся тканей на уровне транскрипции. Если антитела, направленные белковые продукты транскрипции генов до сих пор не разработаны, и / или Есть несколько копий гена белка в частности генома, которые не могут быть дифференцированы с использованием имеющихся антител, в места нахождения имущества может быть использован вместо. Хотя на месте техника для личинок диски крыла стала доступна для бабочки сообщества в течение нескольких лет, текущий протокол был оптимизирован для более крупных и более хрупкими куколки крылья.
Протокол
ДЕНЬ 1
- Подготовьте следующие решения:
- 10x PBS
- 1x PBS
- 1x PBT
- DDH 2 O
- Добавить DEPC на 0,1% общего объема и встряхните решения энергично.
- Автоклав.
- 4% Параформальдегид Fix - с помощью PBS-DEPC
- Протеиназы К решению - если осадок присутствует, вихревые энергично, прежде чем снимать аликвоту
- Буфер Пищеварение Стоп
- Prehybridization буфера
- 50:50 PBT: Prehybridization буфера
- Гибридизация буфера
- Решения должны быть РНКазы бесплатно. Используйте либо стеклянная посуда, которая была запеченная (4 часа при температуре 250 ° С) или одноразовые пластиковые. Серологические пипетки очень полезны для составления решения
- Рассеките крылья от времени поставил куколки в ФСБ
- Перемещение крыльев непосредственно исправить буфера в скважинах от 24-луночного планшета культуры при комнатной температуре
- Fix диски в течение 2 часов
- Вымойте 5 х 5 минут в PBT
- Инкубируйте крылья в течение 3 минут в растворе протеиназы К
- Промыть 2 х в пищеварении Упорный брус
- Вымойте 5 х 5 минут в PBT
- Вымойте 2 х 5 минут в 50:50 PBT: PHB
- Промыть 1 х 10 минут в PHB
- Инкубируйте в PHB не менее 1 часа при температуре 55 ° C.
- Тепло-денатурации РНК зонд (20-50ng необходимы на лунку) (80 ° С в течение 5 минут) и добавить к гибридизации буфере (100 мкл на лунку необходимо)
- Добавить зонд для скважин и инкубировать 48 часов при температуре 55 ° C
ДЕНЬ 3
- Промыть 4 х 5 минут в 55 ° C PHB
- Инкубируйте ночь в PHB при 55 ° С
ДЕНЬ 4
- Подготовьте следующие решения:
- Буфер антител Блок
- Промыть 1 х 5 минут в 50:50 PBT: PHB
- Промыть 4 х 5 минут в PBT
- Инкубируйте крылья в течение 1 часа Блок буфера при 4 ° С
- Инкубируйте крылья в разведении 1:2000 анти-Dig антител течение ночи при 4 ° C
ДЕНЬ 5
- Подготовка следующие решения:
- Обнаружение буфера
- Разработка решений - светочувствительные (завернуть в фольгу)
- Вымойте 3 х 5 минут в PBT при комнатной температуре
- Вымойте 7 х 5 минут в PBT
- Промыть крыльев в два раза за обнаружения буфера
- Разработка крыла в 1 мл Разработка Solution - время развития необходимо контролировать каждый раз - развитие времена могут измениться даже при использовании этих проб и разработки решения - как правило, проверить через 5-10 минут, а затем увеличить интервалы до ночи. Пластина должна быть обернута в фольгу, чтобы предотвратить воздействие света, когда не проверяет образцы.
- Промыть пять раз в развивающихся Стоп буфера
- Горы крылья.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Оптимизация существующих протоколов
В месте гибридизации на личиночной диски крыла были успешно выполнены, используя диски с Precis бабочек coenia (Carroll и др., 1994;. Ключи и др., 1999;. Уэтерби и др., 1999.). Текущий протокол был адаптирован с подробного письменного протокола по запросу из Кэрролла Лаборатории для личинок окрашивания крыла. Изменения, которые мы сделали служат для учета различий между личинок и куколки ткани крыла. Во время куколки hindwing вскрытия, peripodial мембраны должны быть удалены и не включены в скважи...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Мы благодарим Джейн Selegue, Маргарет Холлингсворт, Джин Берри, Ryo Futahashi, Najmus Sahar Mahfooz, Александр Popadic, Боб Рид, Рош технической поддержки за помощью в устранении этого протокола. Мы также благодарим Уильям Piel за консультацией по редактированию фильма.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии | |
|---|---|---|---|---|
| Буфер для фиксации | 4% параформальдегид в PBS | |||
| PBT | 0,1% Tween 20 в PBS | |||
| Раствор протеиназы K | 2,5mg/ml протеиназы K в PBT | |||
| Буфер для остановки переваривания | 2 mg/ml глицина в PBT | |||
| Буфер для прегибридизации | Для 50 ml PHB: 12 ml воды, обработанной DEPC + 25 ml формамида + 12,5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml спермина лосося (без РНКазы, термоденатурированного перед добавлением в раствор). | |||
| Буфер для гибридизации | Добавить 1 mg/ml гликогена к буферу для прегибридизации | |||
| Блокирующий буфер | 50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, 0,5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA | |||
| Anti-DIG | Ab | Roche Group | 11 093 274 910 | Конъюгированный с щелочной фосфатазой |
| Набор буферов для промывки и блокировки DIG | Roche Group | 11 585 762 001 | ||
| Водная среда для заключения Crystal Mount | Sigma-Aldrich | C0612 | Среда для заключения |
Ссылки
- Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings. Science. 265, 109-114 (1994).
- Chomczynski, P. Solubilization in formamide protects RNA from degradation. Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).
- Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution. Science. 283, 532-534 (1999).
- Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).
- Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology. BMC Developmental Biology. 6, 52(2006).
- Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter. BMC Developmental Biology. 6, 55(2006).
- Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns. 9, 109-115 (1999).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
