Методическая статья

Аксоплазме Изоляция от седалищного нерва крысы

13.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/2087

⸱

24 сентября 2010 г.

 ,  , 
1Department of Biological Chemistry, Weizmann Institute of Science

В этой статье

Краткое содержание

Мы демонстрируем протокол для аксоплазме изоляции от взрослой крысы седалищного нерва на основе рассечение нервных пучков и инкубации в гипотонической среде, чтобы освободить миелина и лизировать не-аксонального структур с последующим извлечением оставшейся аксон обогащенного материала.

Аннотация

Выделение чистой аксонального цитоплазмы (аксоплазме) из периферических нервов имеет решающее значение для биохимических исследований многих биологических процессов. В этой статье мы покажем и описать протокол для аксоплазме изоляции от взрослой крысы седалищного нерва основано на следующие этапы: (1) рассечение нервных пучков и разделения соединительной ткани; (2) инкубация коротких сегментов нервных пучков в гипотонической среде освободить миелина и лизировать не-аксонального структур, а также (3) извлечение из оставшихся аксон обогащенного материала. Протеомных и биохимические характеристики этого препарата подтвердили высокую степень обогащения аксонального компонентов.

Протокол

Этот протокол позволяет аксоплазме изоляция с минимизацией глиальных и сосудистых тканей загрязнения. Метод дает примерно 70-100 мкг общего белка аксоплазме на одну неделю 8-10 старых крыс линии Вистар.

1. Рассеките седалищного нерва

  1. Усыпить двух крыс СО 2 ингаляции следуют шейный дислокации. Подтверждение смерти пальпации из-за отсутствия сердцебиения до начала вскрытия.
  2. Тампон рассечение области с 70% этанола.
  3. Сокращение кожи, отдельные мышцы и изолировать седалищного нерва с помощью ножниц и пинцета осторожно, не повреждая кровеносные сосуды. Рассеките и седалищного нервов (около 1,5 см каждый) от каждого животного и собрать все четыре нервы в Эппендорф с 500 мкл PBS 0,2 x + ингибиторы, держится на льду.
  4. Передача нервных сегментов пластической блюд, содержащих не менее 2 мл ФСБ 0,2 x + ингибиторы протеазы.
  5. Удалить эпиневрий от нервов с использованием тонких щипцов под бинокулярным области. Отдельные пучки очень осторожно, пока они не становятся мутными и начинают плавать на поверхности раствора. Этот шаг следует практиковать, пока она может быть выполнена быстро и точно (не считая более чем на 10 мин на нерв).

2. Инкубационный, стиральная и Элюирование

  1. Передача разделенные пучки на новую пробирку Эппендорф с 500 мкл PBS 0,2 x содержащие ингибиторы протеазы для инкубации в течение 2 часов при комнатной температуре.
  2. Мойте по крайней мере 3 раза 1 мл того же буфера путем перечисления пучки из пробирки Эппендорф в пробирку Эппендорфа и встряхивания в течение 5 минут после передачи.
  3. Чтобы удалить избыток жидкости положить пучки в новую пустую пробирку Эппендорфа, а затем передать пучки в новую пробирку Эппендорф с 300 мкл PBS 1X содержащие ингибитор протеазы для инкубации в течение 20-30 минут при комнатной температуре.
  4. Центрифуга 10 мин при 10 000 мкг при 4 ° C.
  5. Возьмите супернатант и концентрации мера белка. Это ваша аксоплазме подготовки.

3. Представитель Результаты

Рисунок 1
Рисунок 1. Иммуноблоттинга сравнения аксоплазме изолированы ручной метод сжатия с аксоплазме образцов изолированных, как показано в этом протоколе. Обратите внимание, снижение уровня альбумина и GFAP, представляющих белков крови и глиальных загрязнений ячейка, соответственно. В противоположность этому, аксонального тубулина b3 обогащается в этом препарате, что указывает на высокий уровень аксонального белков.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Биохимические и протеомных анализов подтвердили, что эта процедура сокращает сыворотку и глиальных клеток загрязнения 3 по сравнению с ранее описанных методов аксоплазме изоляции механического сжатия 1. Мы использовали этот протокол аксоплазме изоляции для изучения динеин основе ретроградной сигнализации после седалищного нерва 2, и ожидать, что она есть полезность в исследование многих других процессов у взрослых периферических нервов, в том числе аксон-глии взаимодействия 4.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Материалы

  • Мужской крыс линии Вистар (8-10 недель)
  • PBS 0,2 x и PBS 1X растворами, содержащими ингибиторы протеазы (Роше) 2 таблетки на 50 мл
  • Eppendorfs по 1,5 мл
  • Стерилизованное пластиковой посуды 35 мм
  • Пройдя инструментов, включая: ножницы и тонкие щипцы
  • Бинокулярный и настольный свет

Антитела

Мышь против GFAP клон GA-5 было от Sigma (G6171). Кролик против Альбумин был из Cedarlane (CLAG5140). Мышь против тубулина β3 и кролика анти-Герк были от Sigma (T2200 и M5670 соответственно).

Ссылки

  1. Hanz, S., Perlson, E., Willis, D., Zheng, J. Q., Massarwa, R., Huerta, J. J., Koltzenburg, M., Kohler, M., van-Minnen, J., Twiss, J. L. Axoplasmic importins enable retrograde injury signaling in lesioned nerve. Neuron. 40, 1095-1104 (2003).
  2. Michaelevski, I., Medzihradszky, K. F., Lynn, A., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. Axonal transport proteomics reveals mobilization of translation machinery to the lesion site in injured sciatic nerve. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 976-987 (2010).
  3. Rishal, I., Michaelevski, I., Rozenbaum, M., Shinder, V., Medzihradszky, K. F., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. Axoplasm isolation from peripheral nerve. Dev Neurobiol. 70, 126-133 (2010).
  4. Twiss, J. L., Fainzilber, M. Ribosomes in axons--scrounging from the neighbors. Trends Cell Biol. 19, 236-243 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи