Изучение воздействия Матрица жесткости на клеточную функцию использования на основе акриламида Гидрогели

Summary

Влияние жесткости субстратов на клеточные функции могут быть смоделированы В пробирке Использованием полиакриламидных гидрогелей различной податливости.

Abstract

Ткань жесткость является важным фактором клеточной функции, а также изменения в ткани жесткость, как правило, связано с фиброзом, рак и сердечно-сосудистые заболевания ^1-11. Традиционные ячейки биологических подходов к изучению клеточной функции включают культивирования клеток на жесткой субстрата (пластиковой посуды или стекла покровные), который не может объяснить влияние упругой ECM или ECM изменения жесткости между тканями. Для моделирования в естественных условиях ткани соблюдением условий в пробирке, и мы, и другие используют ECM-покрытием гидрогелей. В нашей лаборатории, гидрогели на основе полиакриламида, который может имитировать спектр тканей податливости видел биологически ^12. "Реактивный" скользит крышка генерируются путем инкубации с NaOH с последующим добавлением 3-APTMS. Глутаральдегид используется для сшивки 3-APTMS и полиакриламидном геле. Решение акриламида (AC), бис-акриламида (Bis-AC) и персульфата аммония используется для полимеризации гидрогеля. N-гидроксисукцинимида (NHS) включается в решение переменного тока для сшивания ECM белка гидрогеля. После полимеризации гидрогеля, геля поверхность покрыта белков ECM выбора, такие как фибронектин, витронектин, коллаген и др.

Жесткость гидрогеля можно определить по реологии или атомно-силовой микроскопии (АСМ) и корректируется при изменении доли переменного тока и / или бис-AC в решение ^12. Таким образом, субстрат жесткости можно подобрать жесткость биологических тканей, которые также могут быть количественно, используя реологию или АСМ. Клетки могут быть посеяны на этих гидрогелей и культурной основе экспериментальных условиях требуется. Визуализация клеток и их восстановление для молекулярного анализа проста. В этой статье мы определяем мягких субстратах, как те, которые имеют модули упругости (Е) <3000 Паскаль и жесткие субстраты / тканей, как и с Е> 20 000 Паскаль.

Protocol

Подготовка

• Покровные необходимо обрабатывать в автоклаве.
• Стерильной дистиллированной или деионизированной воды должна быть использована для приготовления растворов и для стирки покровные.
• AC (40% вес / объем) и бис-AC (1% м / о) растворы стерилизуют путем фильтрации 0,2 мкм. Подготовка 10% персульфат аммония (APS; 100μg/ml воды) незадолго до использования и стерильный фильтр. Замените APS решение ежемесячно.
• Химические реагенты, такие как 3-APTMS, хлороформ, glutaradehyde, NHS, и SurfaSil которые не могут быть автоклавного хранятся в назначенный бутылки используются исключительно для подготовки гидрогелей.
• Для дости....

Discussion

Одним из важнейших элементов процесса полимеризации гидрогеля, чтобы избежать образования пузырьков воздуха, которая позволит клеткам связываться с покровным стеклом, а не ECM-покрытием гидрогеля себя. Это можно предотвратить, тщательно пипетирования полимеризации в растворе после вортексе и визуально убедившись, что нет воздушных пузырей попасть в ловушку геля. Мы всегда рекомендуем подготовку дополнительных "реактивный" покровные и гидрогелей для обеспечения наличия достаточного для экспериментов.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Глутаральдегид, 70%	Sigma-Aldrich	G7776	в магазине при -20° C
3-APTMS (3-аминопропилтриметосисилан 97%)	Sigma-Aldrich	281778	Хранить при комнатной температуре
SurfaSil Sil	Sil Thermo Fisher Scientific, Inc.	42800	Хранить при комнатной температуре
NHS (N-гидроксисуцинимидный эфир)	Sigma-Aldrich	A-8060	Хранить при 4° C Замените ежемесячный
альбумин, бычью сыворотку, практически без жирных кислот	Sigma-Aldrich	A6003-100G	Хранить в 4° C
Покровные стекла (25 мм)	Fisher Scientific	12-545-86 25 cir 1D
Покровные стекла (18 мм)	Fisher Scientific	12-545-84 18 cir 1D