Влияние жесткости субстратов на клеточные функции могут быть смоделированы В пробирке Использованием полиакриламидных гидрогелей различной податливости.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Изучение воздействия Матрица жесткости на клеточную функцию использования на основе акриламида Гидрогели
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Ткань жесткость является важным фактором клеточной функции, а также изменения в ткани жесткость, как правило, связано с фиброзом, рак и сердечно-сосудистые заболевания 1-11. Традиционные ячейки биологических подходов к изучению клеточной функции включают культивирования клеток на жесткой субстрата (пластиковой посуды или стекла покровные), который не может объяснить влияние упругой ECM или ECM изменения жесткости между тканями. Для моделирования в естественных условиях ткани соблюдением условий в пробирке, и мы, и другие используют ECM-покрытием гидрогелей. В нашей лаборатории, гидрогели на основе полиакриламида, который может имитировать спектр тканей податливости видел биологически 12. "Реактивный" скользит крышка генерируются путем инкубации с NaOH с последующим добавлением 3-APTMS. Глутаральдегид используется для сшивки 3-APTMS и полиакриламидном геле. Решение акриламида (AC), бис-акриламида (Bis-AC) и персульфата аммония используется для полимеризации гидрогеля. N-гидроксисукцинимида (NHS) включается в решение переменного тока для сшивания ECM белка гидрогеля. После полимеризации гидрогеля, геля поверхность покрыта белков ECM выбора, такие как фибронектин, витронектин, коллаген и др.
Жесткость гидрогеля можно определить по реологии или атомно-силовой микроскопии (АСМ) и корректируется при изменении доли переменного тока и / или бис-AC в решение 12. Таким образом, субстрат жесткости можно подобрать жесткость биологических тканей, которые также могут быть количественно, используя реологию или АСМ. Клетки могут быть посеяны на этих гидрогелей и культурной основе экспериментальных условиях требуется. Визуализация клеток и их восстановление для молекулярного анализа проста. В этой статье мы определяем мягких субстратах, как те, которые имеют модули упругости (Е) <3000 Паскаль и жесткие субстраты / тканей, как и с Е> 20 000 Паскаль.
Протокол
Подготовка
- Покровные необходимо обрабатывать в автоклаве.
- Стерильной дистиллированной или деионизированной воды должна быть использована для приготовления растворов и для стирки покровные.
- AC (40% вес / объем) и бис-AC (1% м / о) растворы стерилизуют путем фильтрации 0,2 мкм. Подготовка 10% персульфат аммония (APS; 100μg/ml воды) незадолго до использования и стерильный фильтр. Замените APS решение ежемесячно.
- Химические реагенты, такие как 3-APTMS, хлороформ, glutaradehyde, NHS, и SurfaSil которые не могут быть автоклавного хранятся в назначенный бутылки используются исключительно для подготовки гидрогелей.
- Для дости....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Одним из важнейших элементов процесса полимеризации гидрогеля, чтобы избежать образования пузырьков воздуха, которая позволит клеткам связываться с покровным стеклом, а не ECM-покрытием гидрогеля себя. Это можно предотвратить, тщательно пипетирования полимеризации в растворе после вортексе и визуально убедившись, что нет воздушных пузырей попасть в ловушку геля. Мы всегда рекомендуем подготовку дополнительных "реактивный" покровные и гидрогелей для обеспечения наличия достаточного для экспериментов.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Работы нашей лаборатории проводится при поддержке грантов от Национального института здоровья.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Глутаральдегид, 70% | Sigma-Aldrich | G7776 | Хранить при -20°C |
| 3-APTMS (3-аминопропилтриметоксисилан 97%) | Sigma-Aldrich | 281778 | Хранить при комнатной температуре |
| Силиконизирующая жидкость SurfaSil | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 42800 | Хранить при комнатной температуре |
| NHS (N-гидроксисукцинимидный эфир) | Sigma-Aldrich | A-8060 | Хранить при 4°C, заменять ежемесячно |
| Альбумин сыворотки быка, практически без жирных кислот | Sigma-Aldrich | A6003-100G | Хранить при 4°C |
| Покрывные стекла (25 мм) | Fisher Scientific | 12-545-86 25 Cir 1D | |
| Покрывные стекла (18 мм) | Fisher Scientific | 12-545-84 18 Cir 1D |
Ссылки
- Beattie, D., Xu, C., Vito, R., Glagov, S., Whang, M. C. Mechanical analysis of heterogeneous, atherosclerotic human aorta. J Biomech Eng. 120, 602-607 (1998).
- Bernini, G. Arterial stiffness, intima-media thickness and carotid artery fibros....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
