Здесь мы опишем процедуру для получения темно-адаптированных ломтиками мыши сетчатки для электрофизиологических записей.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Патч зажим Recordings от мыши нейронов сетчатки в темно-адаптированной фрагмент подготовка
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Наш визуальный опыт начинается, когда зрительного пигмента сетчатки в нашей фоторецепторов поглощает фотоны света энергию и инициирует каскад внутриклеточных событий, приведших к закрытию циклических нуклеотидов закрытых каналов в клеточной мембране. В результате изменения мембранного потенциала, в свою очередь приводит к сокращению количества нейромедиаторов релиз с обеих палочек и колбочек синаптических терминалов. Чтобы определить, насколько световых вызвало изменение мембранного потенциала фоторецептора приводит к течению активность в сетчатке, ученые сделали электрофизиологических записей из сетчатки подготовки ломтик за 1,2 лет. В прошлом эти кусочки были вырезаны вручную с лезвием на ткани сетчатки, который прилагается к фильтровальной бумаге, а в последние годы один метод нарезки была разработана котором ткани сетчатки встраивается в странах с низким агар температуры гелеобразования и нарезанный в прохладном растворе с вибрирующий микротома 3,4. Этот препарат производит сетчатки ломтики меньше повреждений поверхности и очень надежные световых вызвали ответы. Здесь документ как эта процедура может быть сделано при инфракрасном свете, чтобы избежать обесцвечивания зрительного пигмента.
Протокол
1. Подготовка электродов
- Подготовка записи и электродов сравнения, опуская их как в 1M NaCl и вождения 15V между ними с помощью 1 Гц синусоидальной волны для ~ 20 с
- Сделать запись электродов использовании микропипетки съемник (Саттер инструменты Р-97). Для патч-пипеток использование боросиликатного стекла с внешним диаметром 1,2 мм и внутренним диаметром 0,69 мм (Саттер Instruments, Cat # B120-69-10). Мера последовательное сопротивление через кончик электрода. На основании размера клетки-мишени выбрать диаметр кончика пипетки, для клеточных тел ~ 20 мкм в диаметре использовать ~ 5 МОм для сотовых тел ~ 5 мкм в диаметре использовать ~ 12 МОм.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Фрагмент записи с сетчатки позвоночных были сделаны десятилетиями 1,2, и были весьма успешны в обеспечении более глубокого понимания того, как схема сетчатки кодирует падающего света. Преимущества резки с вибрирующим микротома, а не непосредственно с лезвием в том, что сетчатки ломтиками несут меньший ущерб на поверхности. С всасывающей пипеткой легко удалить этот ущерб и целевых здоровых клеток прямо под поверхностью, сохраняют свои связи в сетчатке цепи, где большинство типов клеток были идентифицированы
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Эта работа была поддержана NIH Грант EY17606 (APS).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Микропипеточный вытягиватель | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Боросиликатное стекло | Sutter Instrument Co. | B120-69-10 | |
| Полиэтиленовые трубки | Intramedic | PE205 | |
| Агар | Sigma-Aldrich | A7002 | |
| Агароза с низкой температурой гелеобразования | Sigma-Aldrich | A0701 | |
| Среда Эймса (’) | Sigma-Aldrich | A1420 | |
| Пенициллин-стрептомицин | Sigma-Aldrich | P0781 |
Ссылки
- Weblin, F. Transmission along and between rods in the tiger salamander retina. J Physiol. 280, 449-470 (1978).
- Wu, S. M. Synaptic connections among retina neurons in living slices. J Neurosci Methods. 20, 139-149 (1987).
- Rieke, F.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
