В этом протоколе, мы описали новый метод изучения влияния гетерогенности глиальных ячейку аксон роста с В пробирке Со-системе культуры. Крыса корковых глиальные клетки культивировали до слияния и cocultured с высокоочищенного крыс нейроны ганглиев спинного корня. Различные глиальных влияние на нейроны ячейки адгезию и рост аксонов сравнивали непосредственно в той же культуре. Этот метод обеспечивает новый способ непосредственного изучения влияния гетерогенности глиальных ячейку нейрона адгезии и аксонов роста.
Методическая статья
Исследование глиальных Влияние неоднородности сотовый на рост Axon Использование нового метода Coculture
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В центральной нервной системе всех млекопитающих, разорвала аксоны после травмы не в состоянии регенерировать их первоначальными целями и восстановления функций очень плохое 1. Провал регенерации аксонов совместным результатом нескольких факторов, включая враждебные глиальных среде клетки, тормозящий миелина связанных молекул и снижения внутреннего нейрона регенеративной способностью 2. Астроциты являются наиболее преобладающим типом клеток глии в центральной нервной системе и играют важную роль в аксон функций в соответствии с физиологии и патологии условиях 3. Отличие от гомологичной олигодендроцитов, астроцитов являются гетерогенными популяции клеток состоит различными астроцитов субпопуляций с различными морфологии и экспрессии генов 4. Функциональное значение этой неоднородности, такие, как их влияния на рост аксонов, в значительной степени неизвестно.
Для изучения глиальных клеток, особенно функции астроцитов неоднородности в поведении нейронов, мы установили новый метод совместного культивирования высоким спинным очищенный корень ганглиев нейронов с глиальных клеток, полученных от крыс коры головного мозга. По этой техники, мы имели возможность непосредственно сравнить адгезии нейронов и аксонов роста на различных субпопуляций астроцитов при том же условии.
В данном отчете мы приводим подробный протокол этого метода для астроцитов изоляции и культуры, задний корешок ганглиях нейронах выделения и очистки, а также со-культуры DRG нейроны с астроцитов. Этот метод также может быть распространена и на другие области мозга для изучения клеточной или региональной специфики взаимодействия нейронов и глиальных клеток.
Протокол
1. Культура Глия сотовый
Глиальные клетки могут быть культурным из разных регионов центральной нервной системы. Весь процесс показан в процессе фигуры.
День 1 Покрытие пластины культуры и покровные
- Сухой стерилизовать круглые покровные стекла микроскопа в автоклаве.
- Пластина стерилизовать покровных в стерилизованные 24-луночных культуры пластины.
- Пальто покровные с поли-лизина и инкубировать в течение 2 часов под корень температуры.
- Пальто 6-и культуре пластины таким же образом, как шаг 3.
- Вымойте покровные и 6-и культуре пластины в два раза дистиллированной водой и просушите в культуре капотом.
- Добавить 200 мкл среды DMEM (с 10% FBS) в каждую лунку в 24-луночного планшета и 2 мл в каждую лунку в 6-луночный планшет и поместить их в инкубатор под 37 градусов с 5% CO 2
День 2 Изоляция коры и глиальных клеточных культур
- Стерилизовать положительные капот рассечение потока.
- Включите УФ-светом в течение 20 мин.
- Спрей все поверхности с 70% этанола и подождите 15 минут перед использованием.
- Изменение времени: обезболить крысят (P2-P6) на переохлаждение, и обезглавить на базе framen магнум использовании операционных ножницами.
- Открытое черепа вдоль стреловидного шва использованием ножниц радужной оболочки и шелушиться черепа.
- Удаление переднего мозга и положить их в охлажденном L15 среде, под стереомикроскопа, тщательно очистите оболочки и мягкая оболочка с кровеносными сосудами, изолировать коры и промойте несколько раз L15 среды.
- Вырезать коры на мелкие кусочки с ножницами микрохирургии.
- Добавить 0,125% трипсина-EDTA подготовлен с L15 среду на куски коры и инкубировать в 37 градусов в течение 15 мин.
- Передача ткани блоков в 20 мл среды DMEM с 20% FBS в 50 мл трубки, добавьте ДНКазы фондовом решение окончательное 10ug/mL концентрации, аспирация ткани решение вверх и вниз по 20 раз с огнем полированного стекла Pasteure пипетки, собирать суспензии отдельных клеток.
- Вымойте клеточной суспензии один раз с DMEM среде, повторно приостанавливать клеток в DMEM с 10% FBS, граф клетки под микроскопом с гемоцитометра, клетки семян на 5000-10000/cm 2. Поддерживать клетки в 37 градусов 5% инкубатор, изменение половине среды 2 раза в неделю.
2. Спинной корневой Ganglia Нейроны изоляции, культуры и очистки
День 1 Подготовка материальной культуры
- Пальто стерилизовать покровные с поли-лизин, покровные мыть дважды перегонять воду и воздух сухой, положить их в 24-луночных планшетах.
- Добавьте 100 мкл Neurobasal среде с 2% B27 и 2.5S NGF (50 нг / мл), положите пластину на 37 градусов на 5% СО 2.
День 2 изолят ДРГ из эмбрионов
- Стерилизованное поток капот точно так же, как глиальные культуры клеток.
- Эвтаназии беременных крыс (E15) от передозировки с СО 2, стерилизовать живота на 70% этанола, эмбрионы были изолированы от матки и введены в охлажденном L15 среды.
- Изолировать спинной мозг связан с спинной ганглий корня под стереомикроскопа и трансфер в 35 блюд с охлажденной L15 среды.
- Сбор суспензии отдельных клеток и мыть один раз с NBF среды (Neurobasal среде, содержащей 2% B27 и 2.5S NGF (50 нг / мл)).
День 3 Purify DRG нейроны
- 18ч-24ч после посева нейрона, добавить 1 мМ концентрированный раствор фондовом ФУДР к культуре нейрона к конечной концентрации 20 мкМ и конечном объеме 200 мкл.
- 72 часа спустя, заменить половину среды с Neurobasal среде, содержащей 2% B27 и 2.5S NGF (50ng/mL) без ФУДР. После этого, измените среду через день.
3. Coculture DRG нейронов глиальные клетки
- Когда глиальных клеточных культур достигла слияния (около 20 дней после посева), они были готовы к coculture с нейронами.
- 24 часов, прежде чем добавить очищенные нейроны, глиальные клетки среду были изменены на Neurobasal среде, содержащей 2% B27 и 2.5S NGF (50 нг / мл).
- Очищенная нейроны были собраны из культуры скважин, одну подвеску клетки были получены путем механического, проходящих через огонь полированной пипетки Pasteure.
- После подсчета количества, нейроны были посеяны на 500/cm 2 на сливной глиальных клеток в Neurobasal среде, содержащей 2% B27 и 2.5S NGF (50ng/mL).
- Нейроны адгезии и аксонов роста на глиальные клетки могут быть записаны и проанализированы в различные моменты времени на изображение программного обеспечения для анализа и иммуноцитохимии использованием типа клеток специфических антител.
4. Представитель Результаты
- Глиальные культуре клеток: после посева, глиальные клетки станут сливной около 20 дней. В рамках этапа microsc отличиеОПЕ, было легко определить, что различные морфологические глиальных субпопуляций ячейки формируются различные подструктуры модели роста и GFAP положительные астроциты приходилось более 90%, как показали immuocytochemisty техники (рис. 1, рис 2).
- DRG нейроны культуры: В нашем методе лечения после 72 ФУДР часов, чистота DRG нейроны будет достигать 99% в течение 6 дней, DRG нейроны показали свои уникальные морфологии и с высоким ростом аксонов плотности (рис. 3, рисунок 4).
- Глиальных клеток и coculture нейронов: DRG адгезии нейронов и аксонов произошло с готовностью на глиальные клетки в течение 4 часов после посева, тщательные наблюдения показали, что адгезия нейронов и аксонов роста под влиянием глиальные клетки, которая субпопуляций формируется специальный подструктуры модели роста, то это может быть легко идентифицированы под фазового микроскопа отличие и иммуноцитохимии (рис. 5, рисунок 6).
Рисунок 1. Морфология сливной глиальных клеток. Корковая глиальных клеток высевали на полилизином покрытием покровное и культивировали в течение 20 дней, обратите внимание на различные модели роста глиальных клеток, клетки с левой стороны расположены в излучается способом.
Рисунок 2. Сливной глиальных клеток, помеченных Глиальные фибриллярный кислый белок (GFAP) антител. Обратите внимание, излучаемая расположение GFAP (красный) позитивные клетки с правой стороны.
Рисунок 3. Спинной нейроны ганглиев корень вырос в пробирке без лечения ФУДР. Загрязняющих ячейки, образованные DRG фоне нейронов.
Рисунок 4. Спинной нейроны ганглиев корень вырос в пробирке после лечения ФУДР. Фон загрязнения клетки были ликвидированы полностью.
Рисунок 5. Спинной корень ганглиев нейронов, выращенных на глиальных клеток. Нейроны адгезию и рост аксонов были заторможены по излучаемой расположены клетки и ограниченный с правой стороны глиальных клеток.
Рисунок 6. Спинной корень ганглиев нейронов, растущих на глиальные клетки помечены нейрофиламентов антител. Аксонов (зеленый) были заторможены по излучаемой расположены левой стороны глиальных клеток и ограниченный с правой стороны, все глиальные клетки были помечены GFAP антител (красный).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот эксперимент протокол был разработан, чтобы достичь две цели для изучения глиальных клеток, влияние особенно астроцитов неоднородности на нейрон адгезии и аксонов роста. Первая цель заключалась в поддержании астроцитов неоднородность как можно больше, в этом эксперименте, сливающийся глиальных клеток культуры обогащенного астроциты была смешанной первичной культуре без каких-либо химической обработки и распространения пищеварения, что может еще больше ухудшить клетки и вызывают повреждение реакция астроцитов. Оконча...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Это исследование было поддержано FMMU новое открытие фундамент и частично NIH финансирования.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| DMEM (высокое содержание глюкозы) | Invitrogen | 10313-039 | |
| среда L15 | Invitrogen | 11415-114 | |
| FBS | Invitrogen | 10437-077 | |
| среда Neurobasal | Invitrogen | 21103-049 | |
| полилизин | Sigma-Aldrich | P4832 | для культур клеток |
| NGF (2.5S) | Invitrogen | 13257-019 | |
| добавка B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| 0.25% трипсин-ЭДТА | Invitrogen | 25200-056 | |
| FUDR | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| антитела к нейрофиламенту | Abcam | ab24575 |
Ссылки
- Rossignol, S., Schwab, M., Schwartz, M., Fehlings, M. G. Spinal cord injury: time to move? J Neurosci. 27 (44), 11782-11792 (2007).
- Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 7 (8), 617-627 (2006).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Matyash, V., Kettenmann, H. Heterogeneity in astrocyte morphology and physiology. Brain Res Rev. , (2009).
- Wanner, I. B., Deik, A., Torres, M., Rosendahl, A., Neary, J. T., Lemmon, V. P., Bixby, J. L. A new in vitro model of the glial scar inhibits axon growth. Glia. 56 (15), 1691-1709 (2008).
- Kuffler, D. P., Sosa, I. J., Reyes, O. Schwann cell chondroitin sulfate proteoglycan inhibits dorsal root ganglion neuron neurite outgrowth and substrate specificity via a soma and not a growth cone mechanism. J Neurosci Res. 87 (13), 2863-2871 (2009).
- Kleitman, N., Wood, P. M., Bunge, R. P. Tissue culture method for the study of myelination. Culturing nerve cells. , P559-P559 (1998).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE
Запросить разрешение