Этот протокол описывает метод для микронных трехмерных изображений концентрации кислорода в ближайшем окружении живых клеток с помощью электронного микроскопа спинового резонанса.
Методическая статья
Электронного парамагнитного резонанса Микро-изображения живых видов карт для использования с кислородом
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В данном протоколе описан метод микровизуализации методом электронного спинового резонанса (ЭСР) для трехмерного картирования уровней кислорода в непосредственном окружении живых клеток с микронным разрешением1. Кислород является одной из самых важных молекул в жизненном цикле. Он служит терминальным акцептором электронов окислительного фосфорилирования в митохондриях и используется при продукции активных форм кислорода. Измерения уровней кислорода важны для изучения митохондриальных и метаболических функций, сигнальных путей, эффектов различных стимулов, проницаемости мембран и дифференциации заболеваний. Таким образом, потребление кислорода является информативным маркером клеточного метаболизма, который широко применим к различным биологическим системам — от митохондрий и клеток до целых организмов. В связи с его значимостью было разработано множество методов измерения кислорода в живых системах. Современные попытки обеспечить высокое разрешение визуализации кислорода основаны главным образом на методах оптической флуоресценции и фосфоресценции, которые не дают удовлетворительных результатов, так как используют зонды с высокой фототоксичностью и низкой чувствительностью к кислороду. Известно, что ЭСР, измеряющий сигнал от экзогенных парамагнитных зондов в образце, обеспечивает очень точные измерения концентрации кислорода. В типичном случае ЭСР-измерения картируют уширение формы линии зонда и/или сокращение времени релаксации, которые напрямую связаны с локальной концентрацией кислорода. (Кислород парамагнитен, поэтому при столкновении с экзогенным парамагнитным зондом он сокращает его время релаксации.) Традиционно такие эксперименты проводятся с низким разрешением (миллиметрового масштаба ЭСР) для визуализации мелких животных. Здесь мы демонстрируем, как ЭСР-визуализация может быть реализована в микронном масштабе для исследования малых живых образцов. ЭСР-микровизуализация — это относительно новая методология, позволяющая получать пространственно-разрешенные ЭСР-сигналы с разрешением, приближающимся к 1 μm при комнатной температуре2. Основная цель данной статьи-протокола — показать, как этот новый метод в сочетании с недавно разработанными чувствительными к кислороду зондами может быть применен для картирования уровней кислорода в малых живых образцах. Продемонстрировано пространственное разрешение ~30 x 30 x 100 μm с чувствительностью к концентрации кислорода почти на микромолярном уровне и абсолютной чувствительностью к кислороду ниже фемтомоля на воксель. Использование ЭСР-микровизуализации для картирования кислорода вблизи клеток дополняет существующие методы, основанные на микроэлектродах или флуоресценции/фосфоресценции. Кроме того, при использовании подходящего парамагнитного зонда этот метод будет легко применим для внутриклеточной микровизуализации кислорода — возможности, которой очень трудно достичь другими методами.
Протокол
1. Обзор СОЭ Micro-изображений
Во-первых, мы предлагаем краткое объяснение СОЭ, СОЭ микроскопии и различных компонентов нашей системы, и тогда мы будем описывать реальных экспериментах изображений.
Электронного парамагнитного резонанса является спектроскопический метод, в котором электромагнитное излучение на определенной частоте, поглощается молекулами с неспаренных электронных спинов, помещенных под внешнего статического магнитного поля (рис. 1). СОЭ, занятых в широких областях науки, таких как химия, биология, физика и материаловедение, для обнаружения и идентификации свободных радикалов и парамагнитных центров. Это мощный метод изучения окружающей среды парамагнитных молекул в живых видов и дает информацию о кислотности (рН), вязкость, кислорода и активных форм кислорода концентрации 3.
Для гетерогенных образцов, СОЭ спектральной информации можно получить с пространственным разрешением образом (например, путем получения изображения), с помощью градиентов магнитного поля 4. Это очень похоже на более распространенный метод магнитно-резонансной томографии (МРТ), которые в основном наблюдает спины протонов. До сих пор таких изображений СОЭ методы были применены для живых образцов с относительно большим размером несколько сантиметров и в мм масштаба разрешения. (Например, см. рисунок 2, взятый из работы 5.) Сравнительно недавно в ЭПР изображений является расширение ее возможностей, глядя на мелких животных в миллиметровом масштабе резолюции измерения миллиметровом и субмиллиметровом размеров образцов с микронных разрешения. Это поле известно как СОЭ микроскопии, которая сегодня может обеспечить 3D СОЭ изображения с разрешением 1 мкм приближаются 2 (см. представитель примеры в рис. 3).
СОЭ микроскопом по существу аналогична обычной спектрометра ЭПР. Это магнит для генерации статического поля, микроволновые системы для возбуждения спиновых и обнаружения сигнала, зонд для проведения выборки и компьютеризированной консоли для управления процессом сбора и обработки данных. Другие компоненты уникальной СОЭ изображения в целом, а также существующие в ЭПР микроскопии обладают магнитными свойствами градиента поля источников, которые являются частью электронной системы, а также градиентных катушек, которые расположены в визуализации зонда. Более подробную информацию о нашей специфической системе показаны в протоколе кино и описан в ссылке 2.
2. СОЭ Micro-изображений пробоподготовки
Эта стадия описывается метод пробоподготовки для ESR микро-изображений эксперимента. В конце этого этапа клетки располагаются в нижней части, специально подготовленные стекла СОЭ контейнере образцы микроскопии совместно с тритил радикальных 6 буферного раствора. Этот протокол описывает измерение цианобактерий клетки и, следовательно, и для других типов клеток, надлежащее корректировки могут быть необходимы на стадии подготовки образца.
- Во-первых, несколько квадратов впитывающей бумагой с размером ~ 400 400 мкм, принимаются и вставляются в трубку Eppendorf который впоследствии заполнены 1,2 мл цианобактерий подвеска (в концентрации 40 мг / мл).
- Суспензию центрифугируют в течение 2 минут при 6000 оборотов в микроцентрифужных.
- После этого супернатант буфер полностью удалена, за исключением ~ 50 мкл, которые остаются, чтобы избежать обезвоживания цианобактерий. В результате этого процесса, впитывающей бумагой сейчас насыщенный сине-зеленых водорослей клетки.
- Использование тонких пинцеты, несколько волокон выделяются из бумаги и помещают на дно чашки, как специально подготовленные держатель образца стекла 7. После этого 3 мм тритил в BG-11 решение 8, 9 (см. схему 1) добавляется к держателю образца при помощи тонкого шприца. Затем патрон запечатаны использованием УФ-клей, оставляя небольшой выход воздуха открытым.
Сток 4 Складе 3 Складе 2 Месте 1 H 3 BO 3
2.86g/literK 2 HPO 4: 3 H 2 O
4.0g/literMgSO 4: 7H 2 O
7.5g/literNa 2 Mg ЭДТА 0.1g/liter MnCl 2: 4H 2 O
1.81g/literЖелеза 0.6g/liter цитрата аммония ZnSO 4: 7H 2 O
0.222g/literЛимонная кислота: 1H2O
0.6g/literCuSO 4: 5H 2 O
0.079g/literCaCl 2: 2H 2 O
3.6g/literCoCl 2 : 6H 2 O
0.050g/literNaMoO 4: 2H 2 O
0.391g/liter
Схема 1. Подготовка BG-11 среды.
3. СОЭ Микро-изображения Эксперименты
- Во-первых изображений эксперимент, включите СОЭ микро-система формирования изображений и вставьте образца в резонаторе, которая идет внутри изображений зонда.
- Теперь, используя программное обеспечение компьютерного управления, установить систему на фирме "Мелодия" режиме и найти резонансную частоту микроволнового зонда, который будет использоваться для измерения ESR.
- После этого, установите статического магнитного поля на значение, которое соответствует применяются СВЧ, установить временные параметры для импульсной последовательности и наблюдать сигнал ЭПР, чтобы убедиться, что система работает хорошо, и образец хорошо подготовлены.
- Затем установите визуализации параметров, таких как количество пикселей, сила градиентов и длину градиента импульсы к их нужные значения.
- После установки, собрать три 3D-изображений, СОЭ эха Хана визуализации последовательности импульсов (рис. 4) с межимпульсный разделения, значения 500 , 600 и 700 нс.
- Свет прогнозируется на уровне образец включен или выключен в зависимости от требуемых условий эксперимента.
- Во время приобретения, данные автоматически сохраняются. Тезисы исходных файлов данные затем обрабатываются с помощью программного обеспечения Matlab сценарий предоставить изображения тритил радикальных концентрации и релаксации T 2 карты, которая переводится на изображение концентрации кислорода через уже существующие калибровки.
4. Представитель Результаты
Результаты эксперимента несколько трехмерных СОЭ микро-изображения, записанные при различных значениях τ. Типичные необработанных изображений данные приведены на рисунке 5. Тройку изображений, измеренная в темное время суток, очень похожи, за исключением сокращения интенсивности сигнала. С другой стороны, изображение картины изменения под облучении светом из-за различных времен релаксации в различных частях образца. Эти данные могут быть обработаны 1, получим амплитуду изображения, как показано на Рисунке 6, а также образы время релаксации, T 2 (рис. 7). Т 2 изображения переводятся в значения концентрации кислорода через уже существующие калибровочной кривой, которая связывает концентрацию кислорода к времени релаксации с помощью уравнения: 
Здесь T 2 0 является спин-спиновой релаксации зонда в бескислородных условиях (в зависимости от концентрации зонда, C, и ее коэффициент диффузии, D), и к-коэффициент пропорциональности. В большинстве случаев, коэффициент диффузии не сильно отличается для живых образцов (хотя, при необходимости, она может быть в принципе непосредственно оценить также на 6 СОЭ, 10), и спина концентрации, полученные в ходе визуализации процесса. Таким образом, это отношение может быть использован для прямого измерения концентрации кислорода.
Возвращаясь к рис 6, как видно из изображения, которое амплитуда цианобактерий клетки расположены в основном на правой стороне держателя образца. Кроме того, исходя рисунке 7, ясно, что свет начинает производство O 2 и приводит к значительному увеличению концентрации O 2 решения, в основном в вокселей возле цианобактерий.
Рисунок 1: Энергетические уровни электронного парамагнитного резонанса.
Рисунок 2: Типичный образ концентрации кислорода в опухоли мышей подшипника. Изображение слева показывает анатомические сведения, основанные на МРТ изображение. Устойчивые свободные органический радикал вводили мыши и ее СОЭ характеристики обеспечивают концентрацию кислорода в окружающей среде (справа). СОЭ основе результатов накладываются на МРТ анатомические изображения. Поле зрения составляет 32 мм.
Рисунок 3: Два примера высокого разрешения микро-масштабе ESR образы photolithographically генерируемых образца с N @ C 60 порошок (слева) и LiPc парамагнитных кристаллах (справа)
Рисунок 4: Типичные Хан визуализации последовательности импульсов показывает микроволновые (СВЧ) и градиент, G х, у G и G Z импульсов.
Рисунок 5: Типичные необработанных данных СОЭ микро-изображений: а, б, в сырые данные цианобактерии образца без света, освещенность, измеренную при τ = 500 600 700 нс, соответственно. Элементы г, д, и такие же, как, б, в, но светом освещения. Интенсивность строится в произвольном масштабе (но последовательно в пределах каждого набора из трех темных или светлых необработанных изображений данных)
Рисунок 6: Амплитуда изображение, соответствующее концентрации радикалов в растворе (произвольном масштабе).
Рисунок 7: T 2 изображений и соответствующих [O 2] значения при темных (слева) и легкой (справа) условиях.
Обсуждение
Этот протокол показывает, как СОЭ микро-изображения могут быть применены к карте концентрации кислорода около жить малых выборок. Пространственным разрешением ~ 30 х 30 х 100 мкм свидетельствует, с почти микромолярных кислорода чувствительности концентрации и суб-femtomole абсолютная чувствительность кислорода в воксела. Использование ESR микро-изображений для отображения вблизи кислорода клетками дополняет имеющиеся в настоящее время методы, основанные на микро-электродов или флуоресценции / фосфоресценции. Кроме того, с надлежащим парамагнитного зонда, то она будет легко применимы для внутриклеточного кислорода микро-изображения, возможности которых другие методы найти очень трудно достичь. В ближайшем будущем мы планируем дальнейшее совершенствование этой методологии предоставить образец изображения в реальном времени с разрешением в несколько микрон, что обеспечивает контрастность параметры, такие как супер концентрации оксида, кислотность (рН), датчиком коэффициента диффузии и, конечно, концентрации кислорода. Эти возможности дополняют текущий оптико-обоснованных методик как с точки зрения контраста типа, а также образцов характеристик (например, непрозрачная толстых образцов, а в некоторых случаях, внутриклеточные против внеклеточного измерений).
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Эта работа была частично поддержана грантом нет. 213/09 от израильского научного фонда, грант №. 2005258 от ЧФ фундамент, грант №. 201665 от Европейского исследовательского совета (ERC), а также нанотехнологий Рассела Берри института Технион. Мы признаем помощи профессор Ноам Адир и Фарис Саламе факультет Шулиха химии в Технионе в отношении поставки и обработки цианобактерий. Помощь и поддержку Светланы Yoffis из Техниона Micro-Nano Группа Изготовление высоко оценили.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Центрифуга | Kendro | Heraus, 75003235 | |
| Пердейтерированный триарилметильный (тритильный) радикал | Новосибирск | Синтезирован в Новосибирске методом, описанным в источнике 6. | |
| Буфер BG-11 | Инструкцию по приготовлению см. в Схеме 1 и источниках 8, 9. | ||
| Шприц | Hamilton Co | Microliter 7000.5 | |
| УФ-отверждающий клей | Norland Products, Inc. | NOA63 или NOA61. |
Ссылки
- Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. Micro-imaging of Oxygen Concentration near Live Photosynthetic Cells by Electron Spin Resonance. Biophysical Journal. , Forthcoming (2010).
- Blank, A., Suhovoy, E., Halevy, R., Shtirberg, L., Harneit, W. ESR imaging in solid phase down to sub-micron resolution: methodology and applications. J Phys Chem. 11, 6689-6699 (2009).
- Gallez, B., Swartz, H. M. In vivo EPR: when, how and why? NMR Biomed. 17, 223-225 (2004).
- Eaton, G. R., Eaton, S. S., Ohno, K. EPR imaging and in vivo EPR. , CRC Press. Boca Raton. (1991).
- Matsumoto, S. Simultaneous imaging of tumor oxygenation and microvascular permeability using Overhauser enhanced MRI. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 17898-17903 (2009).
- Talmon, Y. Molecular Diffusion in Porous Media by PGSE. ESR. J Phys Chem. , Forthcoming (2010).
- Halevy, R., Talmon, Y., Blank, A. Photolithographic production of glass sample holders for improved sensitivity and resolution in ESR microscopy. Applied Magnetic Resonance. 31, 591-598 (2007).
- Allen, M. M., Stanier, R. Y. Growth and Division of Some Unicellular Blue-Green Algae. J Gen Microbiol. 51, 199-199 (1968).
- Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria. J Gen Microbiol. 111, 1-61 (1979).
- Blank, A., Talmon, Y., Shklyar, M., Shtirberg, L., Harneit, W. Direct measurement of diffusion in liquid phase by electron spin resonance. Chem Phys Lett. 465, 147-152 (2008).
Перепечатки и разрешения
Теги
