Личинки дрозофилы обеспечивают идеальную модель системы для исследования механизмов аксонального транспорта в личиночной сегментарных нервов. Используя эту процедуру, 3-й возраста личинок проведения различных мутаций можно сравнить с диким личинки типа.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Визуализация личинок Сегментные Нервы у 3 Й Инстар Drosophila Подготовка личинок
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Дрозофилы становится мощной системой модель для изучения развития и функционирования нервной системы, особенно из-за его удобного генетики и полностью секвенированы генома. Кроме того, личиночной нервной системы является идеальной системой моделью для изучения механизмов аксонального транспорта, а личиночные сегментарные нервы содержат пучки аксонов с их клеточных тел, расположенных в мозге и их нервными окончаниями конец по всей длине тела. Здесь мы опишем процедуру для визуализации белков синаптических пузырьков в личиночной сегментарные нервы. Если все сделано правильно, все компоненты нервной системы, а также связанные тканей, таких как мышцы и NMJs, остается целой, неповрежденной, и готовы быть визуализированы. 3-го возраста личинки перевозки различных мутаций рассеченные, фиксированной, инкубировали с антителами синаптических пузырьков, визуализации и по сравнению с диким типом личинки. Эта процедура может быть адаптирована для различных синаптические или нейронные антител и изменения в распределении различных белков может быть легко наблюдается в течение личиночной сегментарные нервы.
Протокол
1. Подготовка реагентов
- Приготовьте 1х Dissection буфера с использованием 128 мМ NaCl, CaCl 2 4 мм, 4 мм MgCl 2, 2 мМ KCl, 5 мМ HEPES и 36 Сахароза. PH решение до 7,2 и фильтр стерилизуют.
- Подготовка фиксатором использованием 1:01 разбавления 16% формальдегида и 1x буфера Dissection.
- Приготовьте 1х PBT использованием 1x фосфатно-солевым буфером (PBS) при рН 7,2 и Тритон Х-100 в 1:100 отношение.
- Подготовка 5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) с 0,01% азида Na в 1x PBS.
2. Подготовка к Dissection
- Sylgard блюд используются для вскрытия. Подготовка блюд, поливая Sylgard 184 силиконового эластомера основы и отвердителя смесь в чашки Петри. Позвольте смеси полностью укрепить и сухой перед использованием.
- До вскрытия, собирать чистые пары # 5 щипцы, чистые пары прямым лезвием ножниц vannas, и булавки.
3. Препарирование 3 Личинки й Инстар
- Сбор блуждающих 3-го возраста личинки конкретных генотипов на чашке Петри.
- Вымойте личинок в деионизированной воде, чтобы избавиться от пищи.
- Место личинки на блюдо sylgard, с спинной стороной вверх. Pin личинки на переднем и заднем концах.
- Место капли 1x буфера Dissection на возлагали личинки. Использование тонких ножниц пресечь личинки на спинной средней линии у заднего конца. Использование ножницы, разрезать личиночной кутикулы от заднего конца до переднего конца.
- Место падения новых 1x буфера Dissection на расчлененный личинки. Использование PIN-код, выбрать одного бокового края кутикулы около середины личинки и пин-код кутикулы. Использование другого контактный, контактный второй боковой край кутикулы, как показано на рисунке. Два контакта используются на каждой боковой стороны. См. диаграмму ниже.
- Осторожно удалите кишечник, жир тела, и трахею, оставляя только мозг с двумя оптическими долями и брюшного ганглиев с сегментарных нервов прилагается. Остальная часть процедуры выполняется на блюдо sylgard.
4. Фиксация расчлененный Личинка
- Инкубируйте расчлененный личинки в исправить в течение 30 минут, заменив исправить каждые 15 минут.
- После фиксации, промыть личинки в 1x PBT в течение 30 минут, заменив буфера каждые 10 минут. Важно отметить, что личинки всегда должны быть в буфере.
5. Антитела Окрашивание расчлененный Личинка
- Подготовка первичных антител путем разбавления его в соответствующей концентрации в 5% БСА с Na азида в 1x PBT. Оптимальная концентрация будет отличаться для разных антител.
- Заменить последнее 1x PBT промыть подготовлено решение первичных антител и инкубируют во влажной камере при 4 ° С в течение ночи. Влажной камере строится подкладке пластиковая тарелка с Ким-салфетки, смоченной в воде.
- На следующий день промыть расчлененный личинки в 1x PBT в течение 30 минут, заменив буфера каждые 10 минут.
- Подготовка вторичные антитела путем разбавления его в соответствующей концентрации в 5% БСА с Na азида в 1x PBT, и инкубировать личинку с вторичными антителами решение при 25 ° С в течение часа. Оберните влажной камере в фольгу, чтобы предотвратить свет, как вторичные антитела светочувствительным.
- После инкубации промыть личинки в 1x PBT в течение 30 минут, заменив буфера каждые 10 минут.
6. Монтаж и визуализация расчлененный Личинка
- Перед установкой личинки на слайде, подготовить слайд, распространяя двумя вертикальными линиями лака для ногтей в середине, с пространства достаточно для покровным стеклом, чтобы сидеть на (см. схему). Пусть лак для ногтей полностью высохнуть.
- Место падения монтажного буфера в пространство между вертикальными линиями лака для ногтей на слайде (см. схему). Слайд готов для монтажа.
- После последнего 1x PBT промыть, аккуратно удалите боковые контакты. Будьте осторожны, чтобы не порвать кутикулы.
- Осторожно удалите две оставшиеся контакты и подобрать личинку пинцетом и место личинки горизонтально на подготовленных слайдов. Убедитесь, что личинки не перевернулся и ориентирована вентральной стороной вверх.
- Аккуратно покровным стеклом сверху и печатью края с лаком для ногтей (см. схему). Личинка готова к визуализации под флуоресцентным микроскопом.
7. Представитель Результаты
Рисунок 1: представитель образ личиночной сегментарные нервы от дикого типа larvс использованием антител против белков синаптических белков везикул строку цистеина (CSP, Zinsmaier и соавт. 1994). Обратите внимание, что сегментарные нервы гладко окрашенных. Bar = 20 мкм
Рисунок 2: представитель образ личиночной сегментарные нервы от белка двигателя мутант личинка с использованием антител против синаптических пузырьков белка цистеина строку белка (CSP). Обратите внимание, что сегментарные нервы показать массивные скопления, что пятно ярко для CSP (стрелки).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Дрозофилы личиночной сегментарные нервы мощная система для изучения механизмов в аксонального транспорта. Если 3-го возраста личиночной рассечение выполняется правильно, все компоненты ЦНС, ПНС, и связанные с ними тканей, таких как мышцы и NMJs, могут быть рассмотрены в рамках одной личинки. Мы адаптировали данный протокол от той, опубликованной Херд и Сакстона (1996). Этот протокол также может быть адаптирована для тестирования других нейронов антител, но оптимизация антител должно быть сделано. Пер...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
SG поддерживается за счет средств из государственного университета Нью-Йорка в Буффало и от Джона Р. Oishei Foundation.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Пинцет Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Микропинцеты Minutien, нержавеющая сталь | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Прямые ножницы Mcpherson-Vannas, лезвие 8 см | Fisher Scientific | 50822236 | |
| Vectashield, среда для заключения препаратов | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Силиконовый эластомер Sylgard 184 | Dow Corning | 4026148 | |
| формальдегид, 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| dCSP3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Alexa Fluor 568, козьи антитела к IgG мыши | Invitrogen | A-11004 |
Ссылки
- Gunawardena, S., Goldstein, L. Disruption of Axonal Transport and Neuronal Viability by Amyoid Precursor Protein Mutations in Drosophila. Neuron. 32 (2), 389-401 (2001).
- Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40 (1), 1-2 (2003).
- Hurd, D. D., Saxton, W. M. Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila. Genetics. 144 (3), 1075-1085 (1996).
- Zinsmaier, K. E., Eberle, K. K., Buchner, E., Walter, N., Benzer, S. Paralysis and early death in cysteine string protein mutants of Drosophila. Science. 263, 977-980 (1994).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
