Введем быстрой флуоресценции основе анализа, который контролирует скорость тушения флуоресценции в качестве меры активности канала грамицидина. Грамицидин каналы используются как молекулярные датчики силы, чтобы следить за изменениями в липидных свойства бислоя как воспринимается бислоя охватывающих белков.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Грамицидин основе флуоресценции Пробирной; для определения малых молекул Потенциал Изменение свойств липидного бислоя
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Многие лекарства и другие небольшие молекулы, используемые для модуляции биологические функции амфифилов которые адсорбируются на двухслойных / решения интерфейсом и тем самым изменять свойства липидного бислоя. Это важно, потому мембранных белков являются энергетически связаны с принимающей бислоя путем гидрофобных взаимодействий. Изменения в двухслойных свойства таким образом изменить мембранный белок, функция, которая предоставляет косвенные пути для амфифилов модулировать функцию белка и возможный механизм "вне целевой" эффектов препарата. Ранее мы уже разработаны электрофизиологические тест для обнаружения изменений в липидных свойства бислоя с использованием линейных каналов грамицидина в качестве зондов 3,12. Грамицидин каналы мини-белков образована transbilayer димеризации двух непроводящих субъединиц. Они чувствительны к изменениям в их мембраны окружающей среды, что делает их мощным датчиков для мониторинга изменений в свойства липидного бислоя как воспринимается бислоя охватывающих белков. Теперь мы продемонстрируем флуоресценции тест для обнаружения изменений в двухслойных свойства, используя те же каналы в качестве зондов. Анализ основан на измерении времени ходе тушения флуоресценции от флуорофора загружены большие пузырьки однослойных из-за вступления утоления по каналам грамицидина. Мы используем флуоресценции индикатор / утоления пару 8-aminonaphthalene-1 ,3,6-trisulfonate (муравьи) / Tl +, которая была успешно использована в других анализах тушение флуоресценции 5,13. Tl + пронизывает липидный бислой медленно 8, но легко проходит через проведение грамицидина каналов 1,14. Метод является масштабируемым и подходит как для механистических исследований и высокопроизводительного скрининга малых молекул для двухслойных-возмущающих и потенциальных "вне целевой", эффекты. Мы считаем, что результаты использования этого метода находятся в хорошем согласии с предыдущими результатами электрофизиологических 12.
Протокол
1. Создание ANTS заполненные Липосомы
- На 1-й день, удаление органического растворителя из липидов.
- Удалить липидного из морозильника и позвольте ему равновесие до комнатной температуры.
- Добавить 0,6 мл 25 мг / мл (1,2-dierucoyl-Sn-глицеро-3-фосфохолин) липидов в хлороформе решение 25 мл круглодонную колбу.
- Постоянно вращайте колбу при высыхании в атмосфере азота, пока все хлороформ испарилась и тонкой белой пленки липидного слоя всей нижней части колбы.
- Сушить в эксикаторе под вакуумом в течение ночи.
- На 2-й день, готовят образца с флуорофора, которые будут включены в пузырьки.
- Увлажняет ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мы показали, быстрой флуоресценции основе анализа для определения бислоя изменения потенциала препаратов и других мелких амфифилов. Соединения, которые изменяют свойства бислоя, скорее всего, изменит мембранный белок функции в косвенной, неспецифический образом, возможно, способствует "вне целевой" эффектов препарата. Анализ эксплуатирует мощности грамицидина каналов в качестве зондов для изменения свойств двухслойных 12, которые почувствовали на двухслойных охватывающей белков. Результаты получены .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Предварительная заявка на патент, который охватывает методы, описанные в рукописи было подано. Со-изобретатели НИ и OSA.
Благодарности
Мы благодарим Майкла Дж. Бруно, Радда Русинова и Джон Т. мешок за многочисленные стимулирующие дискуссии. Финансовая поддержка со стороны NIH, R01GM021342 и ARRA дополнения R01GM021342-35S1, и Иосия Мэйси, младший Фонд OSA; Tri-я CMB программа НИ и Iris L. и Леверетта С. Вудворт научный медицинский стипендий и грантов NIH MSTP GM07739 для РК.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| ANTS | Invitrogen | A-350 | |
| грамицидин | Sigma-Aldrich | G-5002 | |
| 1,2-диерукоил-sn-глицеро-3-фосфохолин | Avanti Polar Lipid, Inc | 850398C | |
| Набор для мини-экструдера | Avanti Polar Lipid, Inc | 610000 | |
| Опресняющая колонка PD-10 | Sigma-Aldrich | 54805 |
Ссылки
- Andersen, O. S. Ion transport through simple membranes. Renal Function. Giebisch, G. H., Purcel, E. F. , The Josiah Macy, Jr. Foundation. New York. (1978).
- Andersen, O. S., Koeppe, R. E. Bilayer thickness and membrane protein function: An energetic perspective. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 1....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
