Одноместный Трансфекция сотовый на куриных эмбрионах

Краткое содержание

Использование тонких кончика микропипетки мы вводим плазмиды ДНК в подобластях куриного сомитов или нервных трубок. Концентрация плазмиды регулируется для получения одного трансфекции клеток. Затем мы позволить клеткам развиваться в клональных популяций.

Аннотация

Центральной темой в биологии развития, является диверсификация линий и выяснение основных молекулярных механизмов. Это влечет за собой тщательный анализ судьбы отдельных клеток в норме и при экспериментальных условиях. С этой целью трансфекции методы, ориентированные одного прародителями являются необходимым условием. Мы описываем здесь технически простой метод трансфекции клеток в одной куриной ткани-ово, позволяя надежной линии трассировки, а также генетических манипуляций. Конкретные области ткани направлены в сегмент или нервной трубки, и ДНК вводится непосредственно в эпителии интерес, в результате спорадических трансфекции отдельных клеток. Использование репортеров, клональной населению, могут, следовательно, быть прослежены на срок до трех дней, и поведение генетически модифицированных клональной популяции могут быть по сравнению с контролем. Этот метод использует преимущества доступности куриного эмбриона, а также новые инструменты для генетических манипуляций. Мы сравниваем и обсудить его преимущества по сравнению с широко используемым методом электропорации, и возможные применения и использования в дополнительной в естественных условиях модели также предложил. Мы выступаем за использование этого метода, как существенное дополнение и дополнить существующие линии отслеживания и генетических инструментов вмешательства.

Протокол

1. Подготовка Микропипетки

Тянем наш пипетки на стандартном Narishige PP-83 пипетки съемник с тепловой установки 13.5. Точная установка должна быть откалибрована, направленных на диаметр кончика пипетки от 8 до 10 мкм. Мы используем нити содержащих боросиликатного стеклянные трубки с внешним диаметром 1,0 мм и внутренним диаметром 0.75-0.78 мм. Пипетки, следовательно, хранится в пластиковой посуды с советами защищен от контакта с края тарелки.

2. Подготовка ДНК

Плазмиды интересов трансфицировали в DH5α Е. палочка с помощью стандартных процедур. Ночь культуры из одной колонии используются для очистки плазмид использованием макси-приготовительные комплекты (любой коммерческой комплект должен сделать). Мы используем плазмиды концентрации 1,0 мкг / мкл для не-клональных инъекций. Более высокие концентрации увеличения засорения наконечники для пипеток. Для клональной приложений, плазмиды концентрациях значительно ниже, и должны быть скорректированы (см. ниже). Для pCAGG-GFP, оптимальной концентрации производства клональной результатам было установлено, что около 0,05-0,1 мкг / мкл. От одного до 2 мкл плазмиды обычно используется в эксперименте, и минимальное количество быстрых-зеленый порошок (придерживаясь кончик сухой, резко пипетки стеклянные) добавляется к плазмиды, прежде чем эксперимент начинается. Плазмиду затем центрифугируют в настольной центрифуге в течение 2 минут на максимальной скорости. Эта процедура, кажется, уменьшает пипетки-засорение проблем.

3. Введение эмбрионов

3.1 Подготовка эмбрионов

Мы используем перепелов, а также куриные яйца для инъекций. Яйца насиживают лежа на длинной оси до желаемой стадии развития. Яйца протереть 70% этанолом и высушивают. Заостренный конец яйцо прокалывают с хирургическими ножницами (это необходимо только в куриных яйцах) и 1 мл (в перепелов) или 2 мл (цыпленок) белка взята из яйца с 10 мл шприца (19G иглы). Отверстия затем опечатаны с горячим парафином.

До фактического инъекции, открывается окно в верхней части яичной скорлупы использованием хирургических ножниц. Размещение липкой ленты на оболочку и проходящем через это может помочь уменьшить мусор из оболочки. PBS буфера, содержащего антибиотики пипеткой непосредственно в яйцеклетку. Чтобы получить доступ эмбриона, желточного и / или амниотической мембраны вырезать и отвлекает использованием 0,14-миллиметровыми штекерами насекомых установлен на иглодержателя. Нетоксичные чернила (Пеликан # 17) вводится под бластодерма, чтобы помочь визуализировать эмбрион, используя пожарные вытащил капиллярной установлен на аспиратор.

3,2 Загрузка и установка микропипетки

Съемник микропипетки могут быть загружены с плазмидой огнестрельным вытащил капилляров адекватного диаметра, установлен на аспиратор. Минимальное количество плазмиды рисуется с помощью капиллярного и загружаются в пипетку с момента открытия противоположной заостренным кончиком, и приближается наконечник с внутренней стороны как можно больше. Пипетки, следовательно, загружены на ручной давления воздуха инжектор монтируется на микроманипулятора. Минимальное давление применяется, если это необходимо, для того, чтобы позволить плазмиды решение для достижения кончика пипетки.

3,3 плазмиды инъекции

Пипетки манипулируют в жидкой среде яйца при применении некоторых давление воздуха, чтобы предотвратить засорение кончика пипетки. Соответствующие домена ткани пронзили. Изменение давления, как кончик входит ткань достаточно часто, чтобы освободить плазмиды с видимым быстро зеленый. Если это не так, затем слегка давлением шприца до плазмиды / быстро зеленые выбрасываются. Этот процесс может повторяться вдоль оси эмбриона, например, в соседних сомитов или по степени нервной трубки. После инъекции, PBS может быть добавлен. Окна запечатаны использованием липкой ленты (парафильмом не желательно, особенно для перепелиных яиц повышает ставки зародыш смерти, возможно, блокируя обмен кислорода через оболочку). Лечение эмбрионов возвращаются в инкубатор. Избегайте вентиляции и разместить небольшие емкости с водой в инкубаторе, поскольку они помогают сохранить влагу и повышения урожайности.

4. Настройка параметров впрыска и мониторинг показателей успешности

Asessing и калибровки различных параметров инъекции имеет решающее значение для приложений, направленных на одноклеточных анализа. Не каждая инъекция событие приведет к успешной маркировки одной ячейки. Плазмиды концентрации, которая слишком высока, может привести к не-клональных маркировки, в то время очень низких концентрациях приводить к высоким показателям недостаточности. Концентрация вводят плазмиды должна быть оптимизирована для клональной инъекций. Мы рекомендуем разбавление всей очищенной плазмиды акции, а не разбавляя отдельных подготавливает к заранее определенной концентрации. Последнийможет ввести некоторые различия успеха ставок, вероятно, из-за изменений в чистоте и другие параметры, такие как доля суперспиральной плазмиды.

4,1 Оценка успеха ставки на весь наблюдения горе

Первоначальная оценка вводят эмбрионов может быть выполнен весь монтаж наблюдения под флуоресцентным бинокль. От шести до восьми часов после инъекции являются достаточными для оценки успеха ставки с pCAGG повышенной GFP конструкции. Это предусмотрено целевой сайт поверхностно достаточно, чтобы быть очевидной (например, спинной сомитов, спинной нервной трубки, эктодермы и т.д., см. Рисунок 1A-C.). Этот шаг является особенно полезным для оценки экспериментальных серий экспонирование либо слишком много меченых клеток или, наоборот, не имея флуоресцентных клеток. Если в дальнейшем инкубации желательно, антибиотики содержащие PBS раствор должен быть добавлен в яйце после просмотра и уплотнительная лента должны быть заменены.

4,2 Оценка клональности по серийному сечения анализ

Лучшее средство для оценки темпов успешных инъекций является серийно-секционирования вводят эмбрионов и использование иммуногистохимии для визуализации меченых клеток. В этих условиях, времени инкубации может быть как 4-х часов после инъекции. Эмбрионов фиксируются и обрабатываются для парафиновых срезов (или cryosectioning). Стекло монтажа разделы затем де-paraffinized и иммуно-витражи для репортера визуализации. Усиление методы, такие как биотин-стрептавидин было бы желательно. Наконец, серийных срезов, проверяются для обнаружения меченых клеток в вводили сегментов. Если после первоначального испытания нескольких, а не отдельные клетки получены, плазмиды запас должен быть разведен, и процесс повторяется, пока адекватные результаты будут достигнуты. От двух до 10-кратного разведения плазмиды маточного раствора может оказаться необходимым в случае успеха ставки слишком высоки.

Для каждой плазмиды для трансфекции, тщательная калибровка, что гарантирует клональности следует повторить.

5. Представитель Результаты

Мы обычно проводят однократное введение pCAGG-GFP в сегмент, в то время таргетинга 6-12 сегментов в эмбрионе ^{1 2.} Под этот параметр, четкий сигнал может быть обнаружен целый наблюдения гору 8 часа после инъекции, хотя бы в одном сегменте одного эмбриона из десяти. В этих условиях, маркировка было дополнительно подтверждено быть клональной (рис. 1В, С). При использовании высоких концентраций ДНК, большинство эмбрионов могут проявлять хотя бы один успешный инъекции, повышение возможности того, что несколько ячеек были трансфекции.

Последовательный анализ показал, что раздел клональной трансфекции были достигнуты, когда вероятность успеха была около 10%. Это означает, что для достижения клональности, техника по определению, крайне неэффективно. С другой стороны, в этих условиях, более 93% положительных событий маркировки оказались клональной ^1.

Рисунок 1. Клональный инъекции pCAGGS-GFP в нервные и скелетных прародителей. (AC) поперечном разрезе показывает маркировка спинной нервной трубки (NT) (), вентролатеральной области dermomyotome (DM) (В), или центральная DM лист (С) , 6hr после микроинъекции pCAGGS-GFP к одному прародителя. (D) два дня после клональной трансфекции центральном ДМ, одного прародителей порожденных производных в обоих дермы (D), а также мышцы (М) (см. ссылку ^1. Подробнее).

Обсуждение

Описанный выше метод является модификацией ранее описанной техники для доставки липофильных красителей малого подмножества клеток или одной прародителей ^3. Она имеет три основных преимущества по сравнению со стандартной техникой электропорации. Во-первых, она предоставляет средства для маркировки с уверенностью дискретных сайтов в тканях-мишенях, что позволяет гораздо больше, чем пространственное разрешение электропорации (см., например, рис 1B, С). Во-вторых, она позволяет маркировки отдельных клеток, что по...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Трубки для пипеток	Sutter Instrument Co.	B100-75-10
Капилляры	Drummond Scientific	2-000-100
Иглы для насекомых	Watkins Doncaster	E6871
Pen-Strepping solution	Biological Industries	03-031-1B