Методическая статья

Подготовка Мышь гипофиза Иммуноген для индукции экспериментального аутоиммунного гипофизит

DOI:

10.3791/2181

⸱

17 декабря 2010 г.

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, The Johns Hopkins University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Аутоиммунные гипофизит могут быть воспроизведены у мышей путем введения экстракта мыши белки гипофиза.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Аутоиммунные гипофизит является хроническое воспаление гипофиза причиной или сопровождаться аутоиммунных 1. Он традиционно считается редким заболеванием, но отчетность заметно возросла в последние годы. Гипофизит, по сути, развивается не редкость, как "побочный эффект" у онкологических пациентов, получавших антитела, которые блокируют рецепторы тормозных экспрессируется на Т-лимфоциты, таких как CTLA-4 2 и PD-1 рецепторов. Аутоиммунные гипофизит могут быть вызваны экспериментальным путем введения мышам с гипофизом белки смешать с адъювантной 3. В этом видео статье мы покажем, как извлекать белки из мыши гипофиза и как подготовить их в форму, пригодную для индуцирования аутоиммунных гипофизит в SJL мышей.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экспериментальный протокол

Первым шагом в этом протоколе исследования является сбор большого количества мыши желез гипофиза. Второй шаг заключается в гомогенизации желез подготовить белков экстракта. Третий шаг состоит в эмульсию этих белков с жирной смесью.

Шаг 1: Сбор и хранение мыши гипофиза

Мышь гипофиз находится у основания черепа в депрессию клиновидной кости называют турецкого седла, в окружении бокам тройничного нервов и кпереди от зрительных нервов. Железа состоит из передней доли больших и меньших задней и промежуточной долях, и весит в среднем 1,9 мг. Гипофиза собираются от мышей смешанных штаммов, полов и возрастов, суждено быть умерщвлены с установкой, ухода за животными.

Для выделения гипофизом, мышь эвтаназии, кожу над черепом рассеченные, и кости черепа разрезать ножницами. Мозг поднимается подвергать гипофиза, который затем изолированы от окружающего твердой мозговой оболочки, зачерпнул из клиновидной кости и хранится в пластиковой трубки на сухом льду.

В целом мы используем 300 мышь гипофиза для одного белкового препарата, число, которое может быть собрана одним человеком в 9 часов.

После коллекции будет завершена, трубки, содержащей гипофиза хранится при температуре -80 ° С до готовности для следующего шага.

Шаг 2. Добыча мыши гипофиза белков

  1. Добавить гомогенизации буфер для 15-мл Сокол трубки (каталог не 352 059) держали в ледяной ванне, с помощью 250 мкл буфера на каждые 100 гипофиза собраны. Использование буфера ионной силы похож на тот, который является физиологически присутствующий в цитоплазме клетки (0,2 М) и физиологических рН (7,4). Мы используем фосфатным буферным раствором (0,161 М, рН 7,4), дополненные коктейль ингибиторов протеаз (Sigma-Aldrich, каталог не P8340-1мл).
  2. Добавить гипофиза в буфер перед гомогенизации, а затем поместить генератор (5-мм диаметр) Polytron гомогенизатор на дне пробирки Falcon. Однородный при максимальных оборотов в минуту в течение 30 секунд, плавно перемещая трубку Сокол вверх и вниз, держа его в ледяной ванне. Затем, отдых гомогената на льду в течение 1 мин. Повторите гомогенизации и охлаждения шаги еще два раза. Этот нежный гомогенизации должна сломаться клеток и высвобождение цитозольного белки, не нарушая ядер.
  3. Для удаления ядер, непрерывной ткани и нерастворимых материалов (например, соединительной ткани и денатурированные белковые комплексы), центрифуги гомогената на низкой скорости (1000 г) в течение 10 мин при 4 ° C.
  4. Передача супернатант (сейчас он называется пост-ядерном Супернатант, ПНС) в новую пробирку Falcon, заботясь, чтобы оставить нетронутой гранул, и хранить ПНС на льду.
  5. Ресуспендируют пеллет в первоначальный объем гомогенизации буфере (250 мкл буфера на каждые 100 гипофиза собраны), гомогенизации, как выше, центрифуги, как выше, а затем объединить второй ПНС с первой.
  6. Алиготе два объединения ПНС образцов в микроцентрифужных труб и хранить при температуре -80 ° С до готовности для следующего шага. Этот белковый препарат можно хранить при температуре -80 ° С, но постепенно теряет свою силу, поэтому мы рекомендуем использовать его в течение 6 месяцев с подготовки. Используйте небольшие аликвоты, чтобы определить выход белка и концентрации анализа BCA (Пирс каталога нет. 23225), и качество белка помощью гель-электрофореза. В общем, мы получаем около 60 мг белка от 300 гипофиза мыши в 1,5 мл буфера гомогенизации, при концентрации около 40 мг / мл.

Шаг 3. Подготовка эмульсии для иммунизации

  1. Оттепель быстро замороженные порции белка, необходимого для эксперимента и регулировать концентрации белка до 20 мг / мл. Этот белок экстракт будет эмульгированных 1:1 с полным адъювантом Фрейнда (CFA, Sigma F-5881), содержащий 5 мг / мл тепла убитых микобактерий туберкулеза (Becton Dickinson, 231141). Каждая мышь будет получать по 1 мг экстракта гипофиза в 100 мкл эмульсии.
  2. Пример, приведенный ниже, предназначена для иммунизации 10 мышей, где каждая мышь будет вводили 100 мкл эмульсии, содержащей 1 мг гипофиза белков. Разрешить два дополнительных мышей материальных потерь в период подготовки, так что используйте 12 мг гипофиза белков. Aspire 600 мкл 20 мг / мл гипофизарный экстракт белка описать выше, используя 2,5 мл Гамильтон газонепроницаемый шприц. Ресуспендируют CFA от сотрясения, и стремятся 600 мкл CFA в другой шприц 2,5 мл Гамильтон. Присоединение и безопасный 22 калибра микро-эмульгирующей иглу шприц с КФА. Медленно нажмите на поршень шприца КФА, что игла наполняется CFA, затем приложите и безопасной другой конециглы для шприц с экстрактом гипофиза.
  3. Медленно поршень шприца CFA толкать нефть компонента в acqueous гипофизарный экстракт, например, что только небольшое количество носит смешанный характер. Затем отодвинуть поршень шприца экстракта гипофиза в шприц КФА. Повторите это действие постепенно увеличивая количество материала, смешанный. Продолжайте, пока все содержимое два шприца носят смешанный характер. Вы получите беловатые и равномерно распределенное решение, которое представляет водно-нефтяной эмульсии.
  4. Как только образуется эмульсия, повторите возвратно-поступательное движение по меньшей мере 500 раз, чтобы гарантировать эмульсии тщательно перемешивают. После окончательного смешивания цикла, 1:01 водно-масляная эмульсия готова к использованию и содержит гипофиза концентрации белка 10 мг / мл. Эмульсии будут внесены в тот же день подкожно в анестезии SJL мышей, как указано в статье Юпитеру спутник.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несмотря на то что первый пациент с аутоиммунными гипофизит сообщалось, в 1962 году 4, патогенных гипофиза аутоантигенов еще предстоит идентифицировать 5. Экспериментальные модели на животных могут быть очень полезны в выявлении таких аутоантигенов, содействие открытию биомаркеров, которые переводимые в лечении пациентов. Эта статья продемонстрировала простой процедуры подготовки гипофиза белков в форме, адекватной для индуцирования аутоиммунных гипофизит у экспериментальных животных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана NIH грант DK080351 к ПК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
15 мл пробирки
гомогенизация буфер
фосфат буфер физиологический ингибитор
протеазы коктейль
гомогенизатор
BCA анализPierce, Thermo Scientific23225
Complete Freund& rsquo; s Адъювант (CFA)Sigma-AldrichF-5881
Mycobacterium tuberculosisBD Biosciences231141
2,5 мл Гамильтон газоплотный шприц
22-го калибра микроэмульгирующая игла
FalconPolytron

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Caturegli, P., Newschaffer, C., Olivi, A., Pomper, M. G., Burger, P. C., Rose, N. R. Autoimmune Hypophysitis Endocr Rev. 26, 599-614 (2005).
  2. Blansfield, J. A., Beck, K. E., Tran, K., Yang, J. C., Hughes, M. S., Kammula, U. S., Royal, R. E., Topalian, S. L., Haworth, L. R., Levy, C., Rosenberg, S. A., Sherry, R. M. Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4 blockage can induce autoimmune hypophysitis in patients with metastatic melanoma and renal cancer. J Immunother. 28, 593-598 (2005).
  3. Tzou, S. C., Lupi, I., Landek, M., Gutenberg, A., Tzou, Y. M., Kimura, H., Pinna, G., Rose, N. R., Caturegli, P. Autoimmune Hypophysitis of SJL mice: Clinical Insights from a New Animal Model. Endocrinology. 149, 3461-3469 (2008).
  4. Goudie, R. B., Pinkerton, P. H. Anterior hypophysitis and Hashimoto's disease in a woman. J Pathol Bacteriol. 83, 584-585 (1962).
  5. Caturegli, P. Autoimmune hypophysitis: an underestimated disease in search of its autoantigen(s). J Clin Endocrinol Metab. 92, 2038-2040 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SJL

Похожие статьи