Тестирование Protozoacidal активность лиганд-литических пептиды против термитов Gut Protozoa В пробирке (Protozoa культуры) и В естественных условиях (Микроинъекция в Термит кишке)

Краткое содержание

Мы существующему порядку демонстрации того, что лиганды связываются с поверхностью мембраны целлюлозы переваривания простейших в кишечнике Формозы подземных термитов помощью флуоресцентной микроскопии и лигандов, что в сочетании с литических пептидов убивать этих простейших В пробирке (Анаэробных простейших культуры) и В естественных условиях (Инъекции в кишке термитов).

Аннотация

Мы разрабатываем новый подход к борьбе с подземными термитами, который позволит снизить зависимость от использования химических пестицидов. Подземные термиты зависят от протозоев в задней кишке рабочих особей для эффективного переваривания древесины. Было показано, что литические пептиды уничтожают различные виды протозооных паразитов (Mutwiri et al. 2000), а также протозоев в кишечнике формозанского подземного термита, Coptotermes formosanus (Husseneder and Collier 2009). Литические пептиды являются частью неспецифической иммунной системы эукариот и разрушают мембраны микроорганизмов (Leuschner and Hansel 2004). Большинство литических пептидов вряд ли нанесут вред высшим эукариотам, так как они не воздействуют на электрически нейтральные холестеринсодержащие клеточные мембраны высших эукариот (Javadpour et al. 1996). Действие литических пептидов можно направить на специфические типы клеток путем добавления лиганда. Например, Hansel et al. (2007) сообщили, что литические пептиды, конъюгированные с лигандами рецепторов мембран раковых клеток, могут быть использованы для уничтожения клеток рака молочной железы, в то время как литические пептиды сами по себе или конъюгированные с неспецифическими пептидами оказались неэффективными. Литические пептиды также конъюгировали с человеческими гормонами, которые связываются с рецепторами на опухолевых клетках, для направленного уничтожения клеток рака предстательной и семенной желез (Leuschner and Hansel 2004).

В данной статье мы представляем методы, используемые для демонстрации протозоацидной активности литического пептида (Hecate), соединенного с гептапептидным лигандом, который связывается с поверхностной мембраной протозоев из кишечника формозского подземного термита. Эти методы включают извлечение кишечника рабочих особей термитов, анаэробное культивирование кишечных протозоев (Pseudotrichonympha grassii, Holomastigotoides hartmanni,
Spirotrichonympha leidyi), микроскопическое подтверждение того, что лиганд, меченный флуоресцентным красителем, связывается с протозоями кишечника термитов и другими свободноживущими протозоями, но не с бактериями или тканями кишечника. Мы также демонстрируем, что тот же лиганд, соединенный с литическим пептидом, эффективно уничтожает кишечных протозоев термитов in vitro (культура протозоев) и in vivo (микроинъекции в заднюю кишку рабочих особей), однако обладает меньшей бактерицидной активностью, чем один литический пептид. Гибель протозоев приводит к смерти термитов менее чем через две недели.

В будущем мы создадим с помощью генной инженерии микроорганизмы, способные выживать в задней кишке термитов и распространяться по колонии подобно «троянским коням» для экспрессии лиганд-литических пептидов, которые уничтожат простейших в кишечнике термитов и, как следствие, приведут к гибели термитов в колонии. Лиганд-литические пептиды также могут быть полезны при разработке лекарственных препаратов против паразитических простейших.

Протокол

Эксперимент 1: Добыча термитов кишечнике простейших в анаэробных условиях

1. Используйте блок вентилятора (Кой Laboratories) в перчаточном ящике постоянно циркулировать воздух через осушитель и тип D катализатором Stak-Пакш для контроля влажности и кислорода и устранения неравномерности температур. Заполните перчаточный ящик с непрерывным потоком азота от 20 до 30 мин. Монитор кислорода с кислородным датчиком (С-квадрат, Inc) в течение 1 ч. Использование азота для достижения и поддержания анаэробных условиях, когда это необходимо.
2. Подготовка Трагер U СМИ (Трагер 1934) и отрегулировать рН до 7,0. Брызгать фильтр стерилизованных средств массовой информации в перчаточный ящик со смесью 2,5% водорода, 5% углекислого газа и 92,5% азота в течение 1 ч для удаления кислорода остатков.
3. Silanize все материалы, в том числе предметные стекла, микроцентрифужных трубки, пипетки, изделия из стекла и т.д., используемых в экспериментах с использованием Sigmacote для предотвращения адсорбции простейших или пептиды, на поверхности (Sigmacote, Sigma, # SL-2, http://www.sigmaaldrich.com/ и т.д. / medialib / Docs / Sigma/Product_Information_Sheet/1/sl2pis.Par.0001.File.tmp/sl2pis.pdf).
4. Поскольку простейшие кишечника термитов строго анаэробные организмы, они не должны подвергаться воздействию кислорода. Поэтому следующие шаги выполняются в анаэробных условиях в перчаточном ящике (см. п. 1.1). С щипцы погружаться все тело термитов работника в 70% этанола и осторожно водоворот около 10 с для удаления поверхностных загрязнений.
5. Удалить работника из этанола и дать высохнуть на чистую Kimwipe около 20 с Использование стерильных с острым концом пинцета держать работника живот и захватите кончик брюшка с другой парой щипцов, чтобы аккуратно потянуть кишки вверх или вниз в 45 градусов. Если кишечник втягивается под прямым углом и, слишком сильно она, скорее всего, развалится. Место 10 кишки в капле 100 мкл Трагер СМИ U на предметном стекле микроскопа.
6. Пирс кишки с парой стерильных прекрасно рассекает зондов для выпуска простейших и мягко передачи кишки содержимое пипетки 200 мкл в 1 мл микроцентрифужных пробирку, содержащую 900 мкл Трагер U СМИ. После учета осаждения кишки фрагменты стен (5 сек), передача 900 мкл надосадочной в новую пробирку.
7. Передача 10 мкл простейших культуры sigmacoted слайд микроскопа и проверить состояние простейших под микроскопом при 200-кратном увеличении.
8. Подготовка контроль культур аэробных простейших Tetrahymena pyriformis, Amoeba зр., Эвглены зр. И Paramecium зр. (Каролина Биологические Компания питания, Берлингтон, штат Северная Каролина), а также ночной культуры кишечной палочки в культуральной среде рекомендованные поставщиком.

Эксперимент 2: Добавить лиганд в сочетании с флуоресцентным красителем на простейшие и бактерии культур для проверки привязки к поверхности мембраны и клеточной стенки

Мы использовали фагового дисплея библиотеки (New England Biolabs Inc, Ипсвич, Массачусетс), чтобы определить 19 гептапептида последовательности, которые связываются с простейших (протоколов, доступных на http://www.neb.com/nebecomm/ManualFiles/manualE8110.pdf). Лиганда с пептидной последовательности (ALNLTLH), которые показали сходство с предполагаемым гликопротеины известно из мембраны Trypanosoma brucei был синтезирован, и в сочетании с С-концевой флуоресцентного зонда (EDANS, 5 - ((2-аминоэтил) амино) нафталин-1-сульфокислоты кислоты, λmax = 341 нм, λem = 471 нм) с помощью твердофазного синтеза пептида состоянии (СКЭС), используя смолу EDANS NovaTag (EMD Biosciences). Здесь мы показываем, что лиганд связывается с простейших, которые были выделены из кишечника термитов и других свободно живущих простейших, но не к бактериям.

1. Культура простейших, как описано в Exp. 1. Fix простейших с 10% формальдегида при температуре 4 ° С в течение 12 ч.
2. Центрифуга простейшие решения (30 мкг, 10 мин), отказаться от супернатант и мыть гранул содержащих фиксированный простейших два раза в 1 мл Трагер U СМИ. Повторное приостановить гранул в 1 мл Трагер U СМИ. Кроме того, исправить другие простейшие, и E. кишечной бактерии для элементов управления.
3. Инкубируйте фиксированных микроорганизмов в течение 1-2 ч при решении синтезировали лиганд связан с флуоресцентным красителем EDANS (подготовлен в воде) в конечной концентрации 50 мкМ. Лиганд растворяется в воде лучше, чем Трагер U СМИ.
4. Соблюдайте микроорганизмов под флуоресцентным микроскопом при 400-кратном увеличении на абсорбцию максимум при 341 нм, а излучение в синей области при 471 нм.

Эксперимент 3: Тестирование protozoacidal деятельности лиганд связан с литическим пептида в пробирке (простейшие культуры)

Сопряженное лиганда и литической пептид Геката (Mutwiri и соавт. 2000) ранее был синтезирован в фонд белка ЛГУ.

1. Silanize материалы и подготовить кишечник термитов простейших культуры в анаэробных перчаточный ящикс описанным в Exp. 1.
2. Подготовка культур аэробных микроорганизмов контроля (например, кишечная палочка и свободно живущих видов простейших Т. pyriformis).
3. В анаэробной среде перчаточный ящик, пипетки 6 аликвоты 198 мкл простейших культуры в 0,5 мл пробирок Эппендорф. Добавить 2 мкл 100 мкМ решение лиганд-литических пептида на половину порции (конец концентрации 1 мкМ) в кишечнике термита простейших культуры. Добавьте 2 мкл воды, чтобы другая половина порции (контроля).
4. На настольные, подготовить аналогичные аликвоты Е. палочки и Т. pyriformis с 1 мкМ литических пептид, лиганд-литических пептид или воды.
5. Через 1 ч, передача 10 мкл каждого простейших культуры слайдов. Сравните выживания очищенных простейшие, что и средства управления под микроскопом при 200-кратном увеличении.
6. Через 1 ч пластины по 100 мкл ок. 10 ^-4 разведение Е. кишечной культур на BHI и инкубировать при температуре 37 ° С в течение ночи. Сравните количество колониеобразующих единиц на пластинах.

Эксперимент 4: Введение лиганд связан с флуоресцентным красителем в термитов в кишке

1. Вытяните иглы (Модель GD-1, 1 х 900 мм) с использованием Narishige PC-10 стеклянных микропипетки съемник с двойным уровнем тепла этапа (65 и 48), чтобы получить чаевые размером 20-30 мкм. Подтвердить размер чаевых, измерив ее под микроскопом использованием микрометра.
2. Наполните одну иглу с ок. 30 мкл 50 мкМ флуоресцентно отмечен лиганд, взвешенных в воде, используя прилагаемый шприц. Заполните другую иглу с водой для контроля. Прикрепить микропипетки (0,5 мкл потенциала и 32 мм длиной, ОАО Научно-Драммонд) для держателя в микроманипулятора. Прикрепить иглу держателя системы впрыска в секунду микроманипулятора. Установить исходные параметры инъекция примерно 1 с длительностью импульса и 10-12 фунтов на квадратный дюйм инъекции. Advance иглой медленно в микропипетки и ввести решения с помощью педали управляемой высокоскоростной электронной системой впрыска с контролем длительность импульса придает контролируемого потока газа азота, что обеспечивает постоянный объем воспроизводимо вводили. После инъекции, удалять микропипетки и записывать длину введенного раствора использованием Вернье суппорта. Рассчитать вводят объемом от известных параметров микропипетки. Отрегулируйте давление газа азота и длительность импульса изгнать 0,3 мкл раствора в одной инъекции.
3. Сожмите конец термитов живота работник с мягкой щипцы для удаления настоящее экскрементов в прямой кишке. Остановите термитов работника путем охлаждения их на льду в течение 5 мин.
4. Сделать приемники для проведения рабочих термитов, отрезая 100 мкл наконечники для пипеток использованием лезвие скальпеля. Отрежьте наконечник длиной 10 - 12 мм и использования в соответствии с размером термитов.
5. Прикрепите приемник микроманипулятора. Место работника на чашку Петри на спинной стороне и аспирации работника с головой в приемник с помощью насоса всасывания азота, так что конечная работник выступает из приемника.
6. Холдинг термитами в приемник, тщательно заранее заполненный иглы использованием микроманипулятора чтобы вставить его в рабочий анус. Inject 0,3 мкл раствора (флуоресцентно отмечен лиганд или воды для контроля).
7. Место рабочих вводится с лигандом или воды в отдельные чашки Петри с влажной фильтровальной бумаги и держать их при температуре 26 ± 2 ° С при 78% относительной влажности
8. Искоренить из кишки вводят термитов и собирать простейшие после 24 ч, как показано выше, в Exp. 1. Fix и соблюдать простейшие, как показано на Exp. 2.

Эксперимент 5: Тестирование protozoacidal деятельности лиганд связан с литическим пептида в естественных условиях (инъекции в термитов кишке)

1. Silanize материалы, как описано в Exp. 1.
2. Подготовка 500 мкМ решение лиганд-литических пептида в воде.
3. Выполните шаги 3,1) через 3.4) подготовить стекло иглы, приемников и термитов рабочими.
4. После методов, описанных в 3.5) вводят 0,3 мкл лиганд-литические решения пептид (лечение) или воды (контроль) в кишке на 20 рабочих термитов.
5. Держите термитов в течение 24 ч, искоренить кишки с нескольких рабочих и наблюдать содержимое кишечника под микроскопом, как описано в 3.6). и 3.7).
6. Как только смерть простейших в кишечнике термита подтверждена, сохранить оставшееся лечение термитов и контроля в чашки Петри с влажной фильтровальной бумагой и смертности наблюдать ежедневно.

Представитель Результаты:

Эксперимент 1: Как правило, кишки, кишки и задней кишки получены из одного куска, если процедура выполняется правильно (рис. 1а). Простейших находятся в высокой плотности в анаэробной части задней кишки и могут быть освобождены от пирсинга кишке щипцами (рис. 1, b 1 и 2). Крупнейший протоЗОА видов в кишечнике Формозы подземный термит является веретенообразных П. grassii, которая составляет 200-300 мкм, длину и 150 мкм, и их можно увидеть невооруженным глазом. Второй по величине вид грушевидный H. hartmanni (50-140 мкм долго и 30-80 мкм в ширину). Самый маленький вид конусообразной С. leidyi (15-50 мкм долго и 8-30 мкм, шириной;. Лай и др. 1983). Простейших видов показано на рисунке 2.

При оптимальных условиях культуры трех видов простейших, изолированных из кишечника Формозы подземных термитов останутся живы и здоровы, по крайней мере 72 часов в анаэробных Трагер U средств массовой информации (рис. 3а). Однако, если культура условия не являются оптимальными простейших умрет быстро. Если Есть остатки кислорода в СМИ, движение простейших будут немедленно прекращены. Если осмотическое давление слишком высокое или целостность мембран под угрозу поверхности мембраны простейших будет выпирают и клетки разрыва (рис. 3б). Если осмотическое давление слишком низкое или мембраны оказываются под угрозой, простейшие отсохнет и уменьшаться (рис. 3в).

Эксперимент 2: Мы подтвердили, что лиганд связан с флуоресцентным зондом связан со всеми тремя видами простейших с кишке из Формозы подземных термитов в заметных плотности. Связывание лигандов происходит на всей поверхности клетки (рис. 4). Связывание сайтов сосредоточены в передней части на простейших axostyle (лист микротрубочек) и ядра в P. grassii.

Мы наблюдали некоторый пятнистый аутофлюоресценция древесных частиц попадает в организм простейших. Тем не менее, аутофлюоресценция обычно легко отличить от специфического связывания лиганда, так как нет аутофлюоресценция поверхности, axostyle и ядра (рис. 4).

Мы также обнаружили флуоресценцию, во всех свободно живущих аэробных простейших видов (рис. 5), которая предполагает, что лиганд связывается со структурами общим для простейших. Тем не менее, не лиганд наблюдалась Е. палочки.

Эксперимент 3: Один мкМ лиганд-литических пептид убил всех трех видов простейших из кишечника Формозы подземных рабочих термитов и свободно живущих Т. pyriformis в пробирке менее чем за 10 мин, а контроль остался жив. На рисунке 6 показана прогрессирующая потеря целостности мембран из кишечника термитов простейших получавших лиганд-литических пептидов. Мембраны выпуклость и разрыва, простейшие сморщиваются и погибают. Нет разницы, которая наблюдалась в число Е. кишечной колоний между обработками лиганд-литических пептидов и воды. Литические пептид без каких-либо лиганда, тем не менее, снижение числа E. кишечной колоний значительно (рис. 7). Это говорит о том, что привязанность лиганда в некоторой степени защищает микроорганизмы, не цель из лизиса.

Эксперимент 4: Когда 0,3 мкл 50 мкМ флуоресцентно отмечен лиганд был введен в кишке термитов рабочими, привязка к П. grassii, С. leidyi и H. hartmanni было подтверждено с помощью флуоресцентной микроскопии похож на Exp. 2 (рис. 4). Термиты кишечнике ткани не показали флуоресценции.

Эксперимент 5: Инъекция 0,3 мкл 500 мкМ лиганд-литических пептид убил всех трех видов простейших в кишечнике Формозы подземных термитов в течение 24 часов. Термиты умерли в течение 10 дней после потери их симбиотические простейшие. Ранее Husseneder и Кольер (2009) вводили же концентрации литических пептида в термитов кишки. Без прилагается лиганд, это заняло больше времени, до простейших в кишечнике (72 ч) и термиты были мертвы (шесть недель). Это говорит о том, что лиганд увеличивает эффективность protozoacidal литических пептидов, скорее всего, путем связывания литических пептидов для простейших.

Рисунок 1. : Формозы подземных кишечнике термитов на слайде показаны основные разделы кишки (передней, средней, задней кишки), б 1 и 2: кишке прокалывается щипцами, чтобы освободить кишечник материалов, содержащих простейших.

Рисунок 2. Трех видов жгутиковых простейших обнаружены в задней кишке из Формозы подземный термит:) Pseudotrichonympha grassii, б) Holomastigotoides hartmanni, и в) Spirotrichonympha leidyi.

Рисунок 3. Простейшие в области культуры,) Здоровый простейших, б) простейших с выпученными мембран, в) Иссохшее простейших.

Рисунок 4. Подтверждение связывание лигандов связан с флуоресцентного зонда для термитов кишкипростейших (сверху вниз: П. grassii, Х. hartmanni, С. leydi), обрабатывали флуоресцентно отмечен лиганда и необработанных контрольных (с указанием аутофлюоресценция).

Рисунок 5. Лиганд привязки к свободно живущих аэробных простейших,) Tetrahymena, б) Amoeba, в) эвглены и г) Paramecium.

Рисунок 6. Лечение с простейшими) воды (контроль) и б) 1 мкМ лиганд-литических пептидов.

Рисунок 7. Е. кишечной колоний на чашках (10 ^-4 разведение):) обрабатывают водой (контроль), б) обрабатывали 1 мкМ лиганд-литических пептид, в) обрабатывали 1 мкМ литических пептидов.

Обсуждение

Лиганд-литических пептидов, которые были успешно использованы для эффективного прицельное действие способствует разрушению раковых клеток (Гензель и Лейшнер 2004, Гензель и соавт. 2007). Основываясь на этой концепции, мы разработали гептапептида лиганд, который связывается с поверхностью простейших в кишечнике Формозы подземных термитов, и в сочетании его литических пептида с целью уничтожить эти облигатные целлюлозно-симбионтов переваривания в кишечнике термитов для достижения термит управления (Husseneder и К...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL-2
EDANS	Novabiochem, EMD Millipore
Анаэробный перчаточный бокс	Coy Laboratories, Inc.	Изготовлен на заказ
Контроллер условий окружающей среды Intellus	Percival Scientific, Inc.	I36NL
Стеклотяга для микропипеток PC-10	Narishige International	PC-10
Стеклянные иглы (Модель GD-1, 1 X 900 mm)	Narishige International	GD-1
Микроманипуляторы Leitz	Vermont Optechs, Inc.	ACS01
Микроинжектор	Tritech Research, Inc.	MINJ-1
Microcaps	Drummond Scientific	1-000-0005
Система флуоресцентной визуализации LEICA	Leica Microsystems	DMRxA2
Диссекционный стереомикроскоп LEICA	Leica Microsystems	MZ16
Микроскоп LEICA	Leica Microsystems	DMLB
Диссекционный стереомикроскоп Olympus	Olympus Corporation	SZ61