Методическая статья

Конкретные Маркировка ВИЧ-1-положительных клеток использованием Rev-зависимый лентивирусов Векторный выражая зеленый флуоресцентный белок

16.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/2198

⸱

23 сентября 2010 г.

 ,  , 
1National Center for Biodefense and Infectious Diseases, Department of Molecular and Microbiology, George Mason University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Мы разработали лентивирусов вектор, который обладает, в дополнение к Tat проблематику LTR, Rev-ответ элементов (РРЭ), которые могут регулируют экспрессию гена-репортера в ВИЧ-1 Tat и Rev-зависимым способом. Вектор разрешения специфической детекции репликации ВИЧ в живых клетках с помощью выражения GFP.

Аннотация

Большинство ВИЧ-реагировать векторов экспрессии на основе промоутер ВИЧ, длинный концевой повтор (LTR). Хотя реагировать на ранних белков ВИЧ, Тат, LTR также отзывчив на сотовые состояния активации и локальной активности хроматина, где интеграция произошла. Это может привести к высокой распространенностью ВИЧ-самодеятельность, и ограничил полезность LTR-журналистом, чтобы отметить ВИЧ-положительных клеток 1,2,3. Здесь мы построили выражение лентивирусов вектор, который обладает, в дополнение к Tat проблематику LTR, многочисленные последовательности ДНК ВИЧ, которые включают Rev-ответ элемент и ВИЧ-сайтов сплайсинга 4,5,6. Вектор был включен в лентивирусов вирус репортера, что позволяет очень специфической детекции репликации ВИЧ в живых клеточных популяций. Деятельность вектор измеряли экспрессию белка зеленой флуоресценции (GFP). Применение этого вектора, как сообщили здесь предлагает новый подход альтернативой существующим методам, таким, как на месте ПЦР или ВИЧ-антиген окрашивания, для выявления ВИЧ-положительных клеток. Вектор может также выразить терапевтических генов для основного или клинических экспериментов, чтобы целевая ВИЧ-положительных клеток.

Протокол

1. Трансфекция плазмиды для производства Rev-зависимый лентивирусов Частицы

Установка: Rev-зависимый GFP лентивирусов вектор, НЛП-GFP-РРЭ-SA, был описан ранее 4,5,6. Чтобы собрать в вирусную частицу, плазмиду contransfected в HEK293 Т-клеток с ВИЧ-1 упаковка построить, pCMVΔ8.2 (любезно предоставлены доктором Dider Trono), и плазмиды проведения VSV-G гликопротеин (pHCMV-G) . Трансфекции было проведено с использованием метода фосфата кальция.

Подготовка буферов: 10 х HBS (Hepes солевой буфер) готовили растворением 5 г Hepes, 8 г хлористого натрия, 0,37 г хлорида калия, 1 г декстрозы, 0,103 г Na 2 HPO 4 (безводный) в 100 мл H 2 O. Алиготе the10 X HBS буфер в 1 мл аликвоты и хранят при температуре -20 ° C. Во время трансфекции, конвертировать 10 X HBS до 2 х HBS с H 2 O (1: 5 разведение), а также регулирования рН в пределах от 7,05 - 7,12. (На 10 мл 2 х HBS, как правило, требует примерно 50 мкл 1М NaOH). Фильтры стерилизовать 2X буфера HBS, проходя через 0,22 мкм Millipore фильтр. CaCl 2 буфера было сделано путем растворения CaCl 2 в 10 Hepes мМ до окончательного 2М концентрации. Отрегулируйте рН до 5,8, фильтр стерилизуют буфера и хранить при 4 ° C.

Порядок действий:

  1. За день до трансфекции, семена 2 х 10 6 HEK293T клеток в 100 мм-Петри блюдо, и вырастить клетки на ночь в 10 мл DMEM + 10% ЭТС при 37 ° C, 5% СО 2.
  2. На следующий день, удалить супернатант из клетки и замените 5 мл свежей DMEM + 10% FBS, непрерывно культуры клеток в течение 4 часов.
  3. В 5 мл полистирола трубки, добавляют 480 мкл буфера HBS 2X.
  4. Во второй трубки полистирола 5 мл, добавить 60 мкл 2М CaCl 2 буфера, плазмиды ДНК и трансфекции ТЕ буфера (1 мМ трис, 25 мМ ЭДТА, рН 8,0) в общем объеме 480 мкл. Для каждого Петри блюдо, плазмиды должны быть добавлены в соотношении 10 мкг НЛП-GFP-РРЭ-SA, 7,5 мкг pCMVΔR8.3 и 2,5 мг pHCMV-G.
  5. Добавить плазмиды ДНК-CaCl 2 смеси по каплям 2 трубками X HBS, и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут. Мелкий осадок будет форма.
  6. Добавить 960 мкл смеси по каплям пипеткой к клеткам. Инкубировать при 37 ° C, 5% СО 2 за одну ночь.
  7. На следующий день, удалите супернатант и добавить 10 мл свежей DMEM + 10% FBS, и постоянно инкубации клеток при 37 ° С, 5% СО 2 за одну ночь.
  8. Через 48 часа после трансфекции, урожай вирус удаляя супернатант и передачи его в 50 мл стерильные пробирки. Добавьте свежие 10 мл свежей DMEM + 10% FBS в каждой Петри блюдо и продолжать культуры в одночасье. Магазин вирус супернатант при 4 ° C.
  9. Продолжайте урожай в 72 часа после трансфекции, собирая супернатант. Смешайте все супернатанты, и центрифуга супернатанты на уровне 500 мкг в течение 15 минут для осаждения и удаления ячейки мусора.
  10. Супернатант собирали и фильтруют через 0,22 мкм Millipore фильтр. Вирус был также сосредоточен через гель-столбцов.

2. Концентрат вирусных частиц и определить вирусную Титр

  1. Вирусные частицы были сосредоточены на гель-колонки (100 000 МВт отрезаны, Centricoin). Вирусный супернатант загружается в колонну, и центрифугировали при 6000 мкг при 4 ° С в течение 15 минут.
  2. Концентрированный вирусных супернатант собирали, аликвоты и хранили при температуре -80 ° C.
  3. Вирусный титр определяется заражения TNF-лечение, ВИЧ-1 положительных клеточной линии куртка, J1.1 7. Клетки культивировали в 96 ячейках на уровне 2,5 х 10 5 клеток на мл (100 мл общего объема), а также инфицированы 100 мл последовательно разбавлены VNL-GFP-РРЭ-SA в течение недели. Титр (TCID50) частицы оценивалась путем подсчета GFP положительные скважин по методу Рида и Мюнх 8.

3. Маркировка ВИЧ-1-положительных клеток с лентивирусов частиц, VNL-GFP-РРЭ-SA

Установка: человеческий Т клеток CD4 линии, CEM-SS, впервые инфицированных ВИЧ-1. Через 48 часа после инфекции, клетки superinfected с лентивирусов частиц, VNL-GFP-РРЭ-SA. После суперинфекции в течение еще двух дней, GFP-положительных клеток анализировали с помощью проточной цитометрии. В качестве контроля, ВИЧ-1 неинфицированных CEM-SS клетки одинаково инфицированы VNL-GFP-РРЭ-SA. Только ВИЧ-1-инфицированных CEM-SS клетки породили GFP-положительных клеток, но не ВИЧ-1 неинфицированных CEM-SS клеток.

Порядок действий:

  1. За два часа до инфекции, добавьте polybrane до конечной концентрации 4 мг / мл. Граф клеток и принимать по 2 х 10 5 клеток для каждой инфекции. Инфицировать клетки с 200 нг (p24) ВИЧ-1 NL4-3 в течение 2 часов.
  2. Стиральная клеток центрифуге при 300 мкг в течение 10 минут, ресуспендируютклетки в 2 х 10 5 клеток / мл и культуры при 37 ° С в течение 48 часов.
  3. Граф клеток и принимать по 2 х 10 5 клеток на инфекцию VNL-GFP-РРЭ-SA. Добавить 100 мл VNL-GFP-РРЭ-SA и инкубировать при температуре 37 ° С в течение ночи. Вымойте клетки и ресуспендируют в 2 х 10 5 клеток / мл.
  4. Выполнить анализ проточной цитометрии в 48 часа после суперинфекции. Зараженные клетки осаждали и ресуспендировали в 500 мл 1% paraformaldehede, инкубируют при комнатной температуре в течение 20 минут, а затем анализировали на анализаторе FACScan (Becton Дикенсон).

4. Представитель Результаты

Если эксперименты успешно, значительное население GFP будет обнаружен у ВИЧ-1-инфицированных CEM-SS клеток потока цитометр, тогда как в контрольной, GFP-положительных клеток, не будет обнаружена ВИЧ-1 неинфицированных CEM-SS клеток.

Если эксперименты успешно, Rev-зависимый лентивирусов вектор, VNL-GFP-РРЭ-SA, позволит весьма специфической детекции репликации ВИЧ в живую клетку населения, посредством измерения зеленая флуоресценция белка (GFP) выражении. В этом примере собрано CEM-SS клетки окрашивали РЕ-меченого крысиного моноклонального антитела против CD24 мыши, ЧСА, а затем анализировали на проточном цитометре для АСП и GFP выражения.

Рисунок 1
Рисунок 1. Как показано здесь, значительное население GFP был обнаружен у ВИЧ-1-инфицированных клеток superinfected с VNL-GFP-РРЭ-SA (рис. 1в). В противоположность этому, GFP-положительных клеток не были обнаружены ни в HIV-1 неинфицированных CEM-SS клеток без лентивирусов суперинфекции (рис. 1а) или ВИЧ-1 незараженных клеток с лентивирусов суперинфекции (рис. 1b).

Обсуждение

Как и в ранее разработанных Тат-зависимых векторов выражения, система Rev, описанный здесь, эксплуатация процесс эволюционировал ВИЧ. Включение Rev-зависимость оказывает LTR основе вектора экспрессии в значительной степени зависит от наличия репликации ВИЧ. Применение этого вектора, как сообщили здесь, ВИЧ-зависимых репортер вирус, предлагает новый новый подход для выявления ВИЧ-положительных клеток. Вектор позволяет изучение живых клетках, может выразить любой ген для основных или клинических экспериментов, и, как псевдо-типизированных лентивирус имеет доступ к большинству типов клеток и тканей.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Работа выполнена при частичной поддержке общественной службы здравоохранения грант 1R01AI081568 из NIAID, чтобы YW и щедрые пожертвования доноров и всадники 2009 Поездка NYCDC СПИД организована М. Розен и Day2 ООО

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Бокс биологической безопасности
37°C 5% CO2 инкубатор
Проточный цитометрFACSCalibur
ЦентрифугированиеBeckman Coulter Inc.Allega®6KR
4°холодильник C
-20°холодильник с температурой C
-80°холодильник
Счетчик клетокNexcelom BioscienceCellometer® AutoT4
линия клеток HEK293TНациональные институты здравоохранения
линия клеток CEM-SSНациональные институты здоровья
Линия клеток Jurkat J1.1Национальные институты здравоохранения
DMEM (среда Далтона)Invitrogen11965-118
RPMI 1640Invitrogen21870
FBS с добавлением тепловой инактивацииInvitrogen10438-018
ВИЧ-1NL4-3получены путем трансфекции клеток HeLa клонированной провирусной ДНК
pNL-GFP-RREполное делетирование всех открытых рамок считывания (ORF) ВИЧ в pNL4-3
pNL-GFP-RRE-SAВставка HIV-1 A5 и D4 в pNL-GFP-RRE
pCMVΔ8.2предоставлено доктором Дидером Троно (Dider Trono)
pHCMV-G
10x HBS (солевой буфер с HEPES)Invitrogen11344-041
2M CaCl₂2 буферInvitrogenS-013-154-10
1% параформальдегидSigma-Aldrich158127
Отбеливатель
центрифужные пробирки Falcon объемом 50 млBD Biosciences358206
пробирки с круглым дном объемом 5 млBD Biosciences352063
0.45μфильтр Millipore с порами МEMD MilliporeSLHA033SS
0.20μфильтр Millipore MEMD MilliporeSLFG85000
чашка Петри диаметром 100 ммSigma-AldrichCLS430588
Колонка для эксклюзионной хроматографии (порог отсечения 100 000 Да)Sartorius AGVS2041
криопробирка объемом 2 млAxygen ScientificSCT-200
планшет на 96 лунокBD Biosciences353227
Микроцентрифужная пробирка объемом 1,7 млAxygen ScientificMCT-175-C

Ссылки

  1. Garcia, J. A., Wu, F. K., Mitsuyasu, R., Gaynor, R. B. Interactions of cellular proteins involved in the transcriptional regulation of the human immunodeficiency virus. EMBO Journal. 6, 3761-3770 (1987).
  2. Merzouki, A. HIV-1 gp120/160 expressing cells upregulate HIV-1 LTR directed gene expression in a cell line transfected with HIV-1 LTR-reporter gene constructs. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand. 41, 445-452 (1995).
  3. Aguilar-Cordova, E., Chinen, J., Donehower, L., Lewis, D. E., Belmont, J. W. A sensitive reporter cell line for HIV-1 tat activity, HIV-1 inhibitors, and T cell activation effects. AIDS Res Hum Retroviruses. 10, 295-301 (1994).
  4. Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. Rev-dependent lentiviral expression vector. Retrovirology. 4, 12-12 (2007).
  5. Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. Rev-dependent indicator T cell line. Current HIV Research. 5, 395-403 (2007).
  6. Young, J., Tang, Z., Yu, Q., Yu, D., Wu, Y. Selective killing of HIV-1-positive macrophages and T Cells by the Rev-dependent lentivirus carrying anthrolysin O from Bacillus anthracis. Retrovirology. 5, 36-36 (2008).
  7. Perez, V. L. An HIV-1-infected T cell clone defective in IL-2 production and Ca2+ mobilization after CD3 stimulation. Journal of Immunology. 147, 3145-3148 (1991).
  8. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

GFPHEK 293TCD4

Похожие статьи