Визуализация УФ-индуцированной репликации промежуточных Е. палочки Использование двумерных агарозном гель-анализа

Summary

Мы представляем процедура, посредством которой двумерной агарозном гель-анализ может быть использован для определения структуры репликации промежуточных, которые происходят следующие УФ-облучения.

Abstract

Неточный репликации в присутствии ДНК является причиной большинства сотовых перестановок и мутагенеза наблюдается во всех типах клеток, и многие считают, непосредственно связанные с развитием рака у людей. Повреждение ДНК, как, например, индуцированной УФ-излучением, сильно снижает способность репликации дублировать геномной шаблон точно. Ряд продуктов генов были идентифицированы, которые необходимы при репликации встреч повреждений ДНК в шаблоне. Тем не менее, остающиеся проблемы в том, чтобы определить, как эти повреждения белков процесс во время репликации

Protocol

1. Рост и УФ-облучения.

1. 200 мкл свежей ночной культуры содержащие плазмиды pBR322 выросли в Дэвисе среду ¹ дополнена с 0,4% глюкозы, 0,2% casamino кислоты и 10 мкг / мл тимин (DGCthy среды) и 100 мкг / мл ампициллина является гранулированный. Осадок клеток, затем ресуспендировали в 200 мкл среды DGCthy хватает ампициллин и используют для инокуляции 20 мл DGCthy среды.
2. Культуры, выращенные без ампициллин отбора в пожимая инкубаторе при температуре 37 ° С до OD ₆₀₀ из 0,5 (~ 5 × 10 ^{8 кл} / мл). Рост без ампициллин избегает отбора против ненормального или непродуктивные репликации промежуточные, которые могут возникну....

Discussion

Типичные результаты, полученные от дикого типа клетки в присутствии и в отсутствие УФ-индуцированного повреждения показаны на рисунке 1. При отсутствии повреждений, ~ 1% от общей плазмидной ДНК можно найти в дуге Y, когда клетки быстро растут в экспоненциальной фазе. После облучения, преходящее повышение Y формы молекул наблюдается как заблокированные вилки репликации накапливаются на поврежденные участки. Х-образный промежуточных репликации также временно накапливаться и сохраняться до времени, что коррелирует с при по.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Пример южного анализа 2D гелевого зонда	GE Healthcare	G15T8	Yellow Lighting
15 μ ваттная бактерицидная лампа	Sylvania	F20T12/GO	УФ-лампа
Blak-Ray УФ-интенсивность 254 нм	Daigger	EF28195T	УФ-фотометр
0,025 μ m поровые диски	Whatman, GE Healthcare	VSWP04700	Плавающие диализные диски
PvuII	Fermentas	ER0632	Рестрикция Эндонуклеаза
Nick-translation kit Roche	Group	976776	Для изготовления 32P-меченого зонда
Промокательная бумага	Whatman, GE Healthcare	3030-704	Для южного переноса
Нейлоновая мембрана	GE Healthcare	RPN203S	Для Южного трансфера