Методическая статья

Питатель-Free адаптации, культуры и пассажи клеток человека IPS использованием Полное KnockOut сыворотки питатель-Free Замена среднего

DOI:

10.3791/2236

⸱

15 июля 2010 г.

 , 
1GIBCO, Life Technologies

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Следующий протокол предусматривает обучение для адаптации человека индуцированных плюрипотентных стволовых (IPS) Клетки для фидерных без культуры с помощью полного KnockOut сыворотки питатель-Free Замена среды (КСР-FF). Как только адаптированные, инструкции для постоянного обслуживания также обеспечены.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Открытие в 2006 году, что человеческие и мышиных фибробластов может быть перепрограммирован для получения плюрипотентных клетках 1-3 с качествами, удивительно похожи на эмбриональные стволовые клетки создал новую ценную источником плюрипотентных клеток для открытия новых лекарств, клеточная терапия, и фундаментальных исследований.

GIBCO СМИ и реагенты были на переднем крае плюрипотентных исследований стволовых клеток в течение многих лет. Нокаут DMEM дополнен Нокаут сыворотки Замена средств по выбору для эмбрионального роста стволовых клеток, а теперь плюрипотентных клеточных культур 3-9. Это золотой стандарт системы средств массовой информации теперь может быть использован для подачи без культуры с добавлением Knockout SR Коктейль фактор роста.

Традиционные человека плюрипотентных ES и методов клеточной культуры требует использования мыши или человека слоев фибробластов подачи или подачи с кондиционером среды. Эти культуры методы трудоемки, трудно масштабировать и трудно поддерживать бедра клетки недифференцированной из-за неопределенных условиях. Invitrogen разработала Нокаут SR фактор роста коктейль, чтобы позволить Вам легко перенести ваши бедра культур ячейки подачи без сохраняя при этом ваше использование Нокаут SR.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: Для поддержания стерильных условиях культуры, все процедуры в данном протоколе проводятся с использованием стерильной лабораторной практики и проводится в соответствии ламинарном боксе.

Перед началом, убедитесь, что любые средства массовой информации находится в равновесии до 37 ° С и надлежащим образом в газовых камерах.

Подготовка Geltrex покрытием Блюда культуры

Примечание: см. приложение для использования CELLstart покрытием блюда культуры

  1. Оттепель одна трубка Geltrex (1 мл) медленно при температуре 2-8 ° С и разбавленных 1:100 она в 99 мл Нокаут D-MEM/F-12. Смешайте раствор нежно.

    Примечание: Некоторые линий плюрипотентных клеток могут требовать различные разведения Geltrex для оптимального роста. См. приложение для альтернативного разведения.
  2. Обложка всей поверхности каждой культуры блюдо с решением Geltrex (1 мл на 35-мм блюдо, 1,5 мл для 60-мм блюдо).
  3. Печать каждое блюдо с парафильмом для предотвращения высыхания и инкубировать блюда в течение 1 часа при температуре 37 ° C.

    Примечание: На данном этапе вы можете хранить Geltrex покрытием блюда культуры при 4 ° С в течение 1 месяца. Печать каждое блюдо с парафильмом для предотвращения Geltrex от высыхания.
  4. Перед началом использования, передачи Geltrex покрытием блюда ламинарном боксе и позволит им, чтобы уравновесить до комнатной температуры (около 1 часа).

Подготовка Полное питатель-Free SR KnockOut среднего

  1. Для приготовления 1 мл 10 мкг / мл Базовое решение FGF, асептически смесь компонентов, перечисленных ниже. Алиготе решение и хранить при температуре -20 ° С до 6 месяцев.

    Основные FGF 10 мкг
    D-PBS 990 мкл
    10% BSA 10 мкл


    Примечание: BSA может быть заменен или HSA Нокаут SR на той же концентрации.
  2. Для подготовки 50 мл 2 мг / мл Dispase решение, асептически смесь компонентов, перечисленных ниже. Фильтры стерилизации раствора и хранить при 4 ° С в течение 2 недель.

    Dispase 100 мг
    D-PBS 50 мл
  3. Для подготовки 100 мл полной SR KnockOut питатель-Free (KSR-FF) среду асептически объединить компоненты, перечисленные в таблице ниже.

    Компонент Концентрация сток Конечная концентрация Объем
    Нокаут DMEM/F12 (кат. нет. 12660-012) - 1X 76,8 мл
    GlutaMAX-I (кат. № 35050-061) 200 мМ 2 мМ 1 мл
    KnockOut SR (кат. нет. 10828-028) - 20% 20 мл
    KnockOut SR-GFC (кат. нет. A10580-01) 50X 1X 2 мл
    bFGF (кат. нет. PHG0024) 10 мкг / мл 20 нг / мл 200 мкл
    Вы можете хранить KSR-FF среде при температуре 2-8 ° С не более одной недели.
  4. Перед предварительно уравновешивающая полной среде с температурой и газами, асептически добавить необходимый объем 2 меркаптоэтанол (55 мМ фондовом концентрация) для 0,1 ммоль конечной концентрации. Например, чтобы подготовить 100 мл KSR-FF средний добавить 182 мкл 55 мМ 2-меркаптоэтанол (1:550 разведение) Кроме того, 2-меркаптоэтанол могут быть добавлены к 1X завершены средние и хранить при температуре 2-8 ° С в течение до одной недели.

Адаптация к iPSCs KSR-FF среднего

  1. Перед началом, предварительно уравновешиваются ваш Geltrex покрытием блюд до комнатной температуры в капюшон.
  2. Культура iPSCs на клетки MEF подачи, пока они не 70-80% вырожденная. Пожалуйста, обратитесь к GIBCO мышиных эмбриональных фибробластов пособие для MEF протоколы на основе культуры.
    3. Предварительно теплой необходимый объем Dispase в 37 ° С водяной бане. См. Таблицу 1 ниже для деталей относительно объемов требуется.
  3. Предварительно равновесие необходимый объем KSR-FF в 37 ° С водяной бане for15 мин. См. Таблицу 1 ниже для деталей относительно объемов требуется.
  4. Аспирируйте среды от культуры блюд, а также добавить соответствующее количество Dispase решение. Инкубируйте блюда при температуре 37 ° С в течение 3-5 минут.
  5. Аспирируйте Dispase решения от каждой культуры судна и смыть клетки MEF подачи осторожно D-PBS (от 2 до 3 раза).
  6. Добавить соответствующей суммы полной среды SR KnockOut к каждой культуры судна. Используйте скребок ячейки или 5 мл пипетки, чтобы мягко очистить клетки с поверхности сосуда для культивирования.

    Примечание: см. Приложение альтернативные протоколы адаптации трудно адаптироваться плюрипотентных клеточных линий,
  7. Сбор клеточной суспензии из каждой культуры блюдо на отдельные 15 мл конические пробирки. Промыть каждую культуру сосуд с соответствующим количеством полной среде SR нокаутом, и добавить D-PBS промыть среды в 15 мл конические пробирки, содержащие суспензии клеток. Будьте осторожны, чтобы не сломать ячейки сгустки в одиночных камерах
  8. Центрифуга 15 мл конические пробирки при 200 мкг в течение 5 минут, чтобы гранулы iPSCs.
  9. Аспирируйте супернатант из IPSC гранул. Ресуспендируют пеллет в соответствующее количество KSR-FF среды согласно коэффициенту распределения (табл. 1). Не разбивайте ячейки сгустки до меньшего размера, потому что меньшие сгустки не придают скважины на поверхность.

    Примечание: Мы рекомендуем разделить соотношении 1:2 в течение первых 3 места после iPSCs были пассировали непосредственно из культуральной среды IPSC MEF для KSR-FF среды. Как правило, раскол соотношение между 1:3 и 1:05 уместна, но пассажи в 1:02 обеспечивает более высокую плотность клеток, необходимых при адаптации в фидерных свободной культуры.
  10. До покрытия iPSCs на Geltrex покрытием блюда, аспирации остаточного решение Geltrex из предварительно покрытых блюдо, и постепенно добавить соответствующее количество суспензии клеток в каждой культуре блюдо. Обратите внимание: не полоскать блюд до обшивки.
  11. Перемещение культуры блюдо вперед и назад и из стороны в сторону несколько раз, чтобы разогнать клетки по всей поверхности блюда. Аккуратно культуры блюдо в 37 ° C инкубаторе с влажной атмосфере от 4 до 6% СО 2 в воздухе. Замените провел среде с KSR-FF с каждым днем.

Пассирования клеток человека плюрипотентных использованием KSR-FF

  1. Соблюдайте человека iPSCs растет в полной KSR-FF под микроскопом, чтобы подтвердить, что клетки 70-80% сливной и готова к пересеву. См. Рисунок 1.

    Примечание: Если колонии становятся слишком плотная или слишком большим, увеличилась дифференциация происходит.
  2. Вырежьте и удалите все дифференцированные IPSC колонии до пассажей культуры.
  3. Предварительно теплой необходимый объем Dispase в 37 ° С водяной бане. См. Таблицу 1 ниже для деталей относительно объемов требуется.
  4. Предварительно равновесие необходимый объем KSR-FF в 37 ° С водяной бане for15 мин. См. Таблицу 1 ниже для деталей относительно объемов требуется.
  5. Аспирируйте провел среды из сосуда для культивирования с помощью пипетки, и промойте клетки дважды с D-PBS.
  6. Аккуратно добавить подогретого Dispase решение культуры судна (например, 1 мл раствора на Dispase 60-мм культуры блюдо). Swirl культуры судна, чтобы покрыть всю поверхность клетки.
  7. Инкубируйте культуру судна при температуре 37 ° С в течение 3 минут.
  8. Удалить сосуд из инкубатора, аспирация Dispase решение, и осторожно мыть клетки с D-PBS.
  9. Аккуратно очистить клетки с поверхности культуры блюдо, используя сотовый скребок и передачи клеткам стерильные 15 мл центрифужную пробирку.
  10. Промыть культуры блюдо дважды с KSR-FF, мягко "распыления от" любой клетки, которые не отделены. Бассейн промыть среды с клетками в 15 мл трубки.
  11. Центрифуга трубке при 200 мкг в течение 5 минут при комнатной температуре до гранул клеток.
  12. Тщательно аспирата супернатант, не нарушая осадок клеток и отбросить его.
  13. Аккуратно вылить содержимое трубки, чтобы полностью вытеснить клеточный осадок из трубки вниз.
  14. Аккуратно ресуспендирования клеток в предварительно уравновешенную KSR-FF использованием 5 мл серологические пипетки. Не растирают. Примечание: очень важно, на шаг, чтобы аккуратно ресуспендируют клетки без применения силы, чтобы избежать повреждений.
  15. Передача клетки свежих 60-мм Geltrex покрытием блюдо в нужном Коэффициент распределения и двигаться культуры блюдо вперед-назад и из стороны в сторону несколько раз, чтобы разогнать клетки через ее поверхность.
  16. Место культуры блюдо в 37 ° C инкубаторе с влажной атмосфереОт 4 до 6% СО 2 в воздухе.
  17. На следующий день, мягко заменить провел среде с KSR-FF, чтобы удалить ячейку мусора. Замените провел среда повседневной после этого. Соблюдайте плюрипотентных клетках ежедневно и прохождение их по мере необходимости (примерно раз в 4-5 дней). Пассирования рекомендуется, когда клетки достигают 70-80% слияния. Для КП криоконсервации клеток и оттаивания, обратитесь к нашему протокол под названием "Cryopreserving и восстановление клеток человека плюрипотентных использованием Полное KnockOut сыворотки питатель-Free Замена Medium".

Ожидаемые результаты

Культура клеток под микроскопом; изучение роста клеток; микроскопическая визуализация; биологические исследования.
Рисунок 1. Изображение фазового контраста ниже показаны iPSCs выросли на Geltrex покрытием культуры блюда с использованием полного KnockOut сыворотки питатель-Free Замена среды. IPSCs выставку морфологии похож на ЭСК, характеризуется большими ядрами и скудной цитоплазмой. (40-кратном увеличении)

Компонент 35 блюд Блюдо 60 мм Блюдо 100 мм
Полное KnockOut SR среда 2 мл 4 мл 10 мл
Решение Geltrex 1 мл 1,5 мл 4-5 мл
Dispase 0,5 мл 1 мл 3-4 мл
D-PBS для полоскания 2 мл 4 мл 10 мл

Таблица 1. Рекомендуемые объемы

Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть приложение .

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы этой статьи являются сотрудниками Life Technologies, которая производит реактивы и инструменты, используемые в этой статье.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Среда DMEM/F12 KnockOutКат. № 12660-012Примечание: см. приложение по использованию альтернативных продуктов DMEM
GlutaMAX-IКат. № 35050-061
Заменитель сыворотки KnockOutKnockOut SR, кат. № 10828-028
Коктейль факторов роста KnockOut Serum ReplacementKnockOut SR-GFC, кат. № A10580-01
FGF-basic, рекомбинантный белок человека, 10 μгbFGF, кат. № PHG0024Примечание: см. приложение для ознакомления с альтернативными вариантами фасовки bFGF.
2-меркапто–этанолКат. № 21985-023
ДиспазаКат. № 17105-041Примечание: альтернативные методы пассирования см. в приложении.
Geltrex, квалифицированный для использования с hESC базовый матрикс с пониженным содержанием факторов роста, 1 млКат. № A10480-01
Дульбекко’фосфатно-солевой буферный раствор (D-PBS) без кальция и магния Кат. № 14190-144
Стерильный бокс для культивирования тканей
Инкубатор, настроенный на 37 °C°C
Контроллер пипеток
Водяная баня, установленная на 37 °C°C
Стерильные серологические пипетки (5 мл, 10 мл)
Центрифугирование
центрифугированные пробирки объемом 15 мл
Чашки для культивирования тканей диаметром 60 мм

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  3. Yu, J. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
  4. Maherali, N. Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).
  5. Li, W. Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors. Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).
  6. Liao, J. Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells. Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).
  7. Dimos, J. T. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321, 1218-1221 (2008).
  8. Aasen, T. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).
  9. Park, I. H. Generation of human-induced pluripotent stem cells. Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Gel TRX

Похожие статьи