Cryopreserving и восстановление клеток человека плюрипотентных использованием Полное KnockOut сыворотки питатель-Free Замена среднего

Summary

Этот протокол описывает подробную процедуру cryopreserving плюрипотентных клеток человека в нокаут среду криоконсервации SR и восстановления этих клеток в полной KnockOut SR подачи Free (КСР-FF), средний или подачи основе KnockOut SR среды.

Abstract

Открытие в 2006 году, что человеческие и мышиных фибробластов может быть перепрограммирован для получения плюрипотентных клетках ^1-3 с качествами, удивительно похожи на эмбриональные стволовые клетки создал новую ценную источником плюрипотентных клеток для открытия новых лекарств, клеточная терапия, и фундаментальных исследований.

GIBCO СМИ и реагенты были на переднем крае плюрипотентных исследований стволовых клеток в течение многих лет. Нокаут DMEM дополнен Нокаут сыворотки Замена средств по выбору для эмбрионального роста стволовых клеток, а теперь плюрипотентных клеточных культур ^3-9. Это золотой стандарт системы средств массовой информации теперь может быть использован для подачи без культуры с добавлением Knockout SR Коктейль фактор роста.

Традиционные человека плюрипотентных ES и методов клеточной культуры требует использования мыши или человека слоев фибробластов подачи или подачи с кондиционером среды. Эти культуры методы трудоемки, трудно масштабировать и трудно поддерживать бедра клетки недифференцированной из-за неопределенных условиях. Invitrogen разработала Нокаут SR фактор роста коктейль, чтобы позволить Вам легко перейти ваши бедра и культур ЭСК ячейки подачи без сохраняя при этом ваше использование Нокаут SR.

Protocol

Примечание: Для поддержания стерильных условиях культуры, все процедуры в данном протоколе проводятся с использованием стерильной лабораторной практики и проводится в соответствии ламинарном боксе.

Перед началом, убедитесь, что любые средства массовой информации находится в равновесии до 37 ° С и надлежащим образом в газовых камерах.

Подготовка Geltrex покрытием Блюда культуры

Примечание: см. приложение для использования CELLstart покрытием блюда культуры.

1. Оттепель одна трубка Geltrex (1 мл) медленно при температуре 2-8 ° С и разбавленных 1:100 она в 99 мл Нокаут D-MEM/F-12. Смешайте раствор нежно.
   
   Примечание: Некоторые линий плюрипотентных клеток могут требовать различные разведения Geltrex для оптимального роста. См. приложение для альтернативного разведения.
2. Обложка всей поверхности каждой культуры блюдо с решением Geltrex (1 мл на 35-мм блюдо, 1,5 мл для 60-мм блюдо).
3. Печать каждое блюдо с парафильмом для предотвращения высыхания и инкубировать блюда в течение 1 часа при температуре 37 ° C.
   
   Примечание: На данном этапе вы можете хранить Geltrex покрытием блюда культуры при 4 ° С в течение 1 месяца. Печать каждое блюдо с парафильмом для предотвращения Geltrex от высыхания.
4. Перед началом использования, передачи Geltrex покрытием блюда ламинарном боксе и позволит им, чтобы уравновесить до комнатной температуры (около 1 часа).

Подготовка Полное питатель-Free SR KnockOut среднего

1. Для приготовления 1 мл 10 мкг / мл Базовое решение FGF, асептически смесь компонентов, перечисленных ниже. Алиготе решение и хранить при температуре -20 ° С до 6 месяцев.
   

   Основные FGF	10 мкг
   D-PBS	990μL
   10% BSA	10 мкл

   
   Примечание: BSA может быть заменен или HSA Нокаут SR на той же концентрации.
2. Для подготовки 50 мл 2 мг / мл Dispase решение, асептически смесь компонентов, перечисленных ниже. Фильтры стерилизации раствора и хранить при 4 ° С в течение 2 недель.

   Dispase	100 мг
   D-PBS	50 мл

3. Для подготовки 100 мл полной SR KnockOut питатель-Free (КСР-FF) асептически объединить компоненты, перечисленные в таблице ниже.
   

   Компонент	Концентрация сток	Конечная концентрация	Объем
   Нокаут DMEM/F12 (кат. нет. 12660-012)	-	1X	76,8 мл
   GlutaMAX-I (кат. № 35050-061)	200 мМ	2 мМ	1 мл
   KnockOut SR (кат. нет. 10828-028)	-	20%	20 мл
   KnockOut SR-GFC (кат. нет. A10580-01)	50X	1X	2 мл
   bFGF (кат. нет. PHG0024).	10 мкг / мл	20 нг / мл	200 мкл

   
   Вы можете хранить KSR-FF среде при температуре 2-8 ° С не более одной недели.
4. Перед предварительно уравновешивающая полной среде с температурой и газами, асептически добавить необходимый объем 2 меркаптоэтанол (55 мМ фондовом концентрация) для 0,1 ммоль конечной концентрации. Например, чтобы подготовить 100 мл KSR-FF средний добавить 182 мкл 55 мМ 2-меркаптоэтанол (1:550 разведение) Кроме того, 2-меркаптоэтанол могут быть добавлены к 1X завершены средние и хранить при температуре 2-8 ° С не более одной недели.

Подготовка Замораживание / Криоконсервация среднего

Криоконсервация среда состоит из двух средств массовой информации; Замораживание среднего и морозильные Б. Средний Они будут добавлены к клеткам в разное время и должны оставаться разделены. Каждый из них 50% от общего объема Криоконсервация Средний необходимости. Общий объем Криоконсервация Средний необходимо, так это 1 мл для каждого флакона должны быть заморожены. 90% сливной 60мм блюдо чЭСК могут быть использованы для банка 2 флаконов чЭСК в криоконсервации СМИ.

Подготовка достаточного объема каждого Замораживание среды с дополнительными 2-5 мл для обеспечения превышения.

Замораживание среднего (50% от конечного объема):	50% DMEM/F12	50% КСР
Замораживание среднего B (50% от конечного объема):	80% DMEM/F12	20% ДМСО

Пример:

Если вы замораживания 20 флаконов клетки, вам необходимо 20 мл Криоконсервация Средний. Добавить 4 мл за превышения в общей сложности 24mL Средний Криоконсервация. Это означает, что вам нужно 12 мл замораживания среднего (50% 24mL) и 12 мл замораживания B среднего (50% 24mL).

Замораживание среднего (12 мл):	6 мл DMEM/F12	6 мл KSR
Замораживание среднего B (12 мл):	9,6 мл DMEM/F12	2,4 мл ДМСО

Окончательный состав Криоконсервация среднего составляет 65% DMEM/F12, 25% КСР, а 10% ДМСО.

Cryopreserving iPSCs

1. Предварительно теплой необходимый объем Dispase в 37 ° С водяной бане. См. Таблицу 1 ниже для деталей относительно объемов требуется.
2. Предварительно равновесие необходимый объем KSR-FF в 37 ° С водяной бане for15 мин. Обратитесь к таблице 1below подробнее об объемах требуется.
3. Аспирируйте провел среды из сосуда для культивирования с помощью пипетки, и промойте клетки дважды с D-PBS.
4. Аккуратно добавить подогретого Dispase решение культуры судна (например, 1 мл раствора на Dispase 60-мм культуры блюдо). Swirl культуры судна, чтобы покрыть всю поверхность клетки.
5. Инкубируйте культуру судна при температуре 37 ° С в течение 3 минут.
6. Удалить сосуд из инкубатора, аспирация Dispase решение, и осторожно мыть клетки с D-PBS.
7. Аккуратно очистить клетки с поверхности культуры блюдо, используя сотовый скребок и передачи клеткам стерильные 15 мл центрифужную пробирку.
8. Промыть культуры блюдо дважды с KSR-FF, мягко "распыления от" любой клетки, которые не отделены. Бассейн промыть среды с клетками в 15 мл трубки.
9. Центрифуга трубке при 200 мкг в течение 5 минут при комнатной температуре до гранул клеток.
10. Тщательно аспирата супернатант, не нарушая осадок клеток и отбросить его.
11. Подготовить достаточное количество криопробирки. Как только клетки находятся в контакте с ДМСО, они должны быть аликвоты и замороженные в течение 2-3 минут.
12. Аккуратно вылить содержимое трубки, чтобы полностью вытеснить клеточный осадок из трубки дно и вновь приостановить клеток в Замораживание А. среды [, осторожно пипетирования вверх и вниз с помощью 5-мл серологические пипетки]. После однородной суспензии сгустков, добавляют равный объем Замораживание В средней до этого, в капле мудрым образом, мягко закрученного клеточную суспензию перемешать.
    
    Примечание: На данном этапе клетки находятся в контакте с ДМСО, и работа должна быть выполнена эффективно. Как только клетки находятся в контакте с ДМСО, они должны быть аликвоты и замороженные в течение 2-3 минут.
13. Алиготе 1 мл клеточной суспензии в каждый криопробирку.
14. Быстро место флаконов в морозный г-н [быстро заморозить] и перенести его на -80 ° С в течение ночи.
15. После ночи хранения при температуре -80 ° С, передача клетки резервуар жидкого азота для длительного хранения.

IPSC оттепели флакон и восстановления клеток

Примечание: KSR-FF может быть заменен KSR-содержащих MEF-кондиционированной среды, или KSR средой для использования с фидеров. См. приложение к инструкции по подготовке средств массовой информации.

Предварительно 10 мл теплой KSR-FF среды в 50 мл трубки.

1. Уравновесить соответствующим количеством Geltrex покрытием блюд до комнатной температуры и аспирации жидкости из любого блюда непосредственно перед покрытием выГ клеток.
2. Осторожно снимите чЭСК (или IPSC) флакон с жидкой резервуар для хранения азота.
3. Быстро размораживайте флакон клеток в 37 ° С водяной бане, пока только небольшой кусок замороженного остается во флаконе.
4. Спрей флакон с 70% изопропанола для обеззараживания его и перенести его на стерильную капот культуры ткани.
5. Асептических условиях передачи все содержимое флакона в 15 мл коническую трубку с помощью 5 мл пипетки.
6. Промойте флакон с 1 мл KSR-FF и добавьте к 15 мл центрифужную пробирку.
7. Медленно, добавить 4 мл KSR-FF каплям к ячейкам в 15 мл коническую трубку. При добавлении среде, мягко перемещать зонд вперед и назад, чтобы смесь клеток. (Это уменьшает осмотический шок для клеток).
8. Центрифуга 15 мл трубки с клеточной суспензии при 1000rpm (200 х г) в течение 2 минут при комнатной температуре.
9. Тщательно аспирации и отбросить супернатант, не нарушая клеточный осадок.
10. Повторное приостановить осадок клеток в подогретого KSR-FF (например 4mL/60 мм блюдо) с помощью 5 мл пипетки и осторожно пипеткой клетки вверх и вниз, пока осадок клеток полностью рассеялись. Жизнеспособность более 70%, как ожидается, поэтому если жизнеспособность составляет менее 70%, это может занять больше времени для клеток достичь слияния.
11. Используя ту же пипетку, передачи клеточной суспензии по каплям к Geltrex покрытием культуры блюдо предварительно доведены до комнатной температуры.
12. Место культуры блюдо в 37 ° С инкубатор, с влажной атмосфере от 4 до 6% СО ₂ в воздухе. Тщательно водоворот судна в направлении с севера на юг, с востока на запад шаблон, чтобы равномерно распределить клетки.
13. Аккуратно жидкостью изменить культуру блюдо 24 часа после оттепели и ежедневно после этого удалить ячейки мусором, а также предоставить свежие питательные вещества, пока блюдо составляет примерно 70-80% вырожденная. Для сохранения культуры и пассажи ваш плюрипотентных клеток, обратитесь к нашему протокол под названием "питатель-Free культуры и пассажи плюрипотентных клеток человека использовании Полное KnockOut сыворотки Замена подачи среды без"

Ожидаемые результаты

Клетки должна быть примерно 70-80% сливной до криоконсервации. Dispase пищеварения результатов в керлинг и складывания колоний вдоль колонии полей. После сбора урожая клетки они заморожены как маленькие сгустки в криоконсервации СМИ. Как только флакон оттаяли, восстановить клетки и приложить к предварительно покрытых блюдо как небольшие пряди. Они растут быстро, ведущие к сливной блюдо в 5-6 дней.

Таблица 1 - Рекомендуемые объемы

Компонент	35 блюд	Блюдо 60 мм	Блюдо 100 мм
Полное KnockOut SR среда	2 мл	4 мл	10 мл
Решение Geltrex	1 мл	1,5 мл	4-5 мл
Dispase	0,5 мл	1 мл	3-4 мл
D-PBS для полоскания	2 мл	4 мл	10 мл

Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть приложение .

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Knockout DMEM/F12		12660-012	Примечание: см. приложение об использовании альтернативных продуктов DMEM GlutaMAX-I (Cat. No 35050-061)
KnockOut Serum Replacement		10828-028
KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail		A10580-01
FGF-basic, человеческий рекомбинантный белок, 10 μ g		PHG0024	Примечание: альтернативные размеры упаковки bFGF см. в приложении.
2-Меркапт– thanol		21985-023
Dispase		17105-041	Примечание: см. приложение для альтернативных методов пассирования
Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 мл		A10480-01
Dulbecco' s Фосфатно-солевой буфер (D-PBS) без кальция и магния		14190-144
DMSO, 500 мл	JT Baker	JT9224-1
			для стерильных культур тканей
в наборе 37° C
Pipette-Aid
на 37° C
Стерильные серологические пипетки (5 мл, 10 мл)
Центрифуга
пробирки
60 мм Чашки
, Резервуар
азота Контейнеры			для заморозки изопропанола
1,5 мл криовиалов