Методическая статья

Cryopreserving и восстановление клеток человека плюрипотентных использованием Полное KnockOut сыворотки питатель-Free Замена среднего

19.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/2237

⸱

15 июля 2010 г.

 , 
1GIBCO, Life Technologies

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает подробную процедуру cryopreserving плюрипотентных клеток человека в нокаут среду криоконсервации SR и восстановления этих клеток в полной KnockOut SR подачи Free (КСР-FF), средний или подачи основе KnockOut SR среды.

Аннотация

Открытие в 2006 году, что человеческие и мышиных фибробластов может быть перепрограммирован для получения плюрипотентных клетках 1-3 с качествами, удивительно похожи на эмбриональные стволовые клетки создал новую ценную источником плюрипотентных клеток для открытия новых лекарств, клеточная терапия, и фундаментальных исследований.

GIBCO СМИ и реагенты были на переднем крае плюрипотентных исследований стволовых клеток в течение многих лет. Нокаут DMEM дополнен Нокаут сыворотки Замена средств по выбору для эмбрионального роста стволовых клеток, а теперь плюрипотентных клеточных культур 3-9. Это золотой стандарт системы средств массовой информации теперь может быть использован для подачи без культуры с добавлением Knockout SR Коктейль фактор роста.

Традиционные человека плюрипотентных ES и методов клеточной культуры требует использования мыши или человека слоев фибробластов подачи или подачи с кондиционером среды. Эти культуры методы трудоемки, трудно масштабировать и трудно поддерживать бедра клетки недифференцированной из-за неопределенных условиях. Invitrogen разработала Нокаут SR фактор роста коктейль, чтобы позволить Вам легко перейти ваши бедра и культур ЭСК ячейки подачи без сохраняя при этом ваше использование Нокаут SR.

Протокол

Примечание: Для поддержания стерильных условиях культуры, все процедуры в данном протоколе проводятся с использованием стерильной лабораторной практики и проводится в соответствии ламинарном боксе.

Перед началом, убедитесь, что любые средства массовой информации находится в равновесии до 37 ° С и надлежащим образом в газовых камерах.

Подготовка Geltrex покрытием Блюда культуры

Примечание: см. приложение для использования CELLstart покрытием блюда культуры.

  1. Оттепель одна трубка Geltrex (1 мл) медленно при температуре 2-8 ° С и разбавленных 1:100 она в 99 мл Нокаут D-MEM/F-12. Смешайте раствор нежно.

    Примечание: Некоторые линий плюрипотентных клеток могут требовать различные разведения Geltrex для оптимального роста. См. приложение для альтернативного разведения.
  2. Обложка всей поверхности каждой культуры блюдо с решением Geltrex (1 мл на 35-мм блюдо, 1,5 мл для 60-мм блюдо).
  3. Печать каждое блюдо с парафильмом для предотвращения высыхания и инкубировать блюда в течение 1 часа при температуре 37 ° C.

    Примечание: На данном этапе вы можете хранить Geltrex покрытием блюда культуры при 4 ° С в течение 1 месяца. Печать каждое блюдо с парафильмом для предотвращения Geltrex от высыхания.
  4. Перед началом использования, передачи Geltrex покрытием блюда ламинарном боксе и позволит им, чтобы уравновесить до комнатной температуры (около 1 часа).

Подготовка Полное питатель-Free SR KnockOut среднего

  1. Для приготовления 1 мл 10 мкг / мл Базовое решение FGF, асептически смесь компонентов, перечисленных ниже. Алиготе решение и хранить при температуре -20 ° С до 6 месяцев.
    Основные FGF 10 мкг
    D-PBS 990μL
    10% BSA 10 мкл

    Примечание: BSA может быть заменен или HSA Нокаут SR на той же концентрации.
  2. Для подготовки 50 мл 2 мг / мл Dispase решение, асептически смесь компонентов, перечисленных ниже. Фильтры стерилизации раствора и хранить при 4 ° С в течение 2 недель.
    Dispase 100 мг
    D-PBS 50 мл
  3. Для подготовки 100 мл полной SR KnockOut питатель-Free (КСР-FF) асептически объединить компоненты, перечисленные в таблице ниже.
    Компонент Концентрация сток Конечная концентрация Объем
    Нокаут DMEM/F12 (кат. нет. 12660-012) - 1X 76,8 мл
    GlutaMAX-I (кат. № 35050-061) 200 мМ 2 мМ 1 мл
    KnockOut SR (кат. нет. 10828-028) - 20% 20 мл
    KnockOut SR-GFC (кат. нет. A10580-01) 50X 1X 2 мл
    bFGF (кат. нет. PHG0024). 10 мкг / мл 20 нг / мл 200 мкл

    Вы можете хранить KSR-FF среде при температуре 2-8 ° С не более одной недели.
  4. Перед предварительно уравновешивающая полной среде с температурой и газами, асептически добавить необходимый объем 2 меркаптоэтанол (55 мМ фондовом концентрация) для 0,1 ммоль конечной концентрации. Например, чтобы подготовить 100 мл KSR-FF средний добавить 182 мкл 55 мМ 2-меркаптоэтанол (1:550 разведение) Кроме того, 2-меркаптоэтанол могут быть добавлены к 1X завершены средние и хранить при температуре 2-8 ° С не более одной недели.

Подготовка Замораживание / Криоконсервация среднего

Криоконсервация среда состоит из двух средств массовой информации; Замораживание среднего и морозильные Б. Средний Они будут добавлены к клеткам в разное время и должны оставаться разделены. Каждый из них 50% от общего объема Криоконсервация Средний необходимости. Общий объем Криоконсервация Средний необходимо, так это 1 мл для каждого флакона должны быть заморожены. 90% сливной 60мм блюдо чЭСК могут быть использованы для банка 2 флаконов чЭСК в криоконсервации СМИ.

Подготовка достаточного объема каждого Замораживание среды с дополнительными 2-5 мл для обеспечения превышения.

Замораживание среднего (50% от конечного объема): 50% DMEM/F12 50% КСР
Замораживание среднего B (50% от конечного объема): 80% DMEM/F12 20% ДМСО

Пример:

Если вы замораживания 20 флаконов клетки, вам необходимо 20 мл Криоконсервация Средний. Добавить 4 мл за превышения в общей сложности 24mL Средний Криоконсервация. Это означает, что вам нужно 12 мл замораживания среднего (50% 24mL) и 12 мл замораживания B среднего (50% 24mL).

Замораживание среднего (12 мл): 6 мл DMEM/F12 6 мл KSR
Замораживание среднего B (12 мл): 9,6 мл DMEM/F12 2,4 мл ДМСО

Окончательный состав Криоконсервация среднего составляет 65% DMEM/F12, 25% КСР, а 10% ДМСО.

Cryopreserving iPSCs

  1. Предварительно теплой необходимый объем Dispase в 37 ° С водяной бане. См. Таблицу 1 ниже для деталей относительно объемов требуется.
  2. Предварительно равновесие необходимый объем KSR-FF в 37 ° С водяной бане for15 мин. Обратитесь к таблице 1below подробнее об объемах требуется.
  3. Аспирируйте провел среды из сосуда для культивирования с помощью пипетки, и промойте клетки дважды с D-PBS.
  4. Аккуратно добавить подогретого Dispase решение культуры судна (например, 1 мл раствора на Dispase 60-мм культуры блюдо). Swirl культуры судна, чтобы покрыть всю поверхность клетки.
  5. Инкубируйте культуру судна при температуре 37 ° С в течение 3 минут.
  6. Удалить сосуд из инкубатора, аспирация Dispase решение, и осторожно мыть клетки с D-PBS.
  7. Аккуратно очистить клетки с поверхности культуры блюдо, используя сотовый скребок и передачи клеткам стерильные 15 мл центрифужную пробирку.
  8. Промыть культуры блюдо дважды с KSR-FF, мягко "распыления от" любой клетки, которые не отделены. Бассейн промыть среды с клетками в 15 мл трубки.
  9. Центрифуга трубке при 200 мкг в течение 5 минут при комнатной температуре до гранул клеток.
  10. Тщательно аспирата супернатант, не нарушая осадок клеток и отбросить его.
  11. Подготовить достаточное количество криопробирки. Как только клетки находятся в контакте с ДМСО, они должны быть аликвоты и замороженные в течение 2-3 минут.
  12. Аккуратно вылить содержимое трубки, чтобы полностью вытеснить клеточный осадок из трубки дно и вновь приостановить клеток в Замораживание А. среды [, осторожно пипетирования вверх и вниз с помощью 5-мл серологические пипетки]. После однородной суспензии сгустков, добавляют равный объем Замораживание В средней до этого, в капле мудрым образом, мягко закрученного клеточную суспензию перемешать.

    Примечание: На данном этапе клетки находятся в контакте с ДМСО, и работа должна быть выполнена эффективно. Как только клетки находятся в контакте с ДМСО, они должны быть аликвоты и замороженные в течение 2-3 минут.
  13. Алиготе 1 мл клеточной суспензии в каждый криопробирку.
  14. Быстро место флаконов в морозный г-н [быстро заморозить] и перенести его на -80 ° С в течение ночи.
  15. После ночи хранения при температуре -80 ° С, передача клетки резервуар жидкого азота для длительного хранения.

IPSC оттепели флакон и восстановления клеток

Примечание: KSR-FF может быть заменен KSR-содержащих MEF-кондиционированной среды, или KSR средой для использования с фидеров. См. приложение к инструкции по подготовке средств массовой информации.

Предварительно 10 мл теплой KSR-FF среды в 50 мл трубки.

  1. Уравновесить соответствующим количеством Geltrex покрытием блюд до комнатной температуры и аспирации жидкости из любого блюда непосредственно перед покрытием выГ клеток.
  2. Осторожно снимите чЭСК (или IPSC) флакон с жидкой резервуар для хранения азота.
  3. Быстро размораживайте флакон клеток в 37 ° С водяной бане, пока только небольшой кусок замороженного остается во флаконе.
  4. Спрей флакон с 70% изопропанола для обеззараживания его и перенести его на стерильную капот культуры ткани.
  5. Асептических условиях передачи все содержимое флакона в 15 мл коническую трубку с помощью 5 мл пипетки.
  6. Промойте флакон с 1 мл KSR-FF и добавьте к 15 мл центрифужную пробирку.
  7. Медленно, добавить 4 мл KSR-FF каплям к ячейкам в 15 мл коническую трубку. При добавлении среде, мягко перемещать зонд вперед и назад, чтобы смесь клеток. (Это уменьшает осмотический шок для клеток).
  8. Центрифуга 15 мл трубки с клеточной суспензии при 1000rpm (200 х г) в течение 2 минут при комнатной температуре.
  9. Тщательно аспирации и отбросить супернатант, не нарушая клеточный осадок.
  10. Повторное приостановить осадок клеток в подогретого KSR-FF (например 4mL/60 мм блюдо) с помощью 5 мл пипетки и осторожно пипеткой клетки вверх и вниз, пока осадок клеток полностью рассеялись. Жизнеспособность более 70%, как ожидается, поэтому если жизнеспособность составляет менее 70%, это может занять больше времени для клеток достичь слияния.
  11. Используя ту же пипетку, передачи клеточной суспензии по каплям к Geltrex покрытием культуры блюдо предварительно доведены до комнатной температуры.
  12. Место культуры блюдо в 37 ° С инкубатор, с влажной атмосфере от 4 до 6% СО 2 в воздухе. Тщательно водоворот судна в направлении с севера на юг, с востока на запад шаблон, чтобы равномерно распределить клетки.
  13. Аккуратно жидкостью изменить культуру блюдо 24 часа после оттепели и ежедневно после этого удалить ячейки мусором, а также предоставить свежие питательные вещества, пока блюдо составляет примерно 70-80% вырожденная. Для сохранения культуры и пассажи ваш плюрипотентных клеток, обратитесь к нашему протокол под названием "питатель-Free культуры и пассажи плюрипотентных клеток человека использовании Полное KnockOut сыворотки Замена подачи среды без"

Ожидаемые результаты

Клетки должна быть примерно 70-80% сливной до криоконсервации. Dispase пищеварения результатов в керлинг и складывания колоний вдоль колонии полей. После сбора урожая клетки они заморожены как маленькие сгустки в криоконсервации СМИ. Как только флакон оттаяли, восстановить клетки и приложить к предварительно покрытых блюдо как небольшие пряди. Они растут быстро, ведущие к сливной блюдо в 5-6 дней.

Таблица 1 - Рекомендуемые объемы

Компонент 35 блюд Блюдо 60 мм Блюдо 100 мм
Полное KnockOut SR среда 2 мл 4 мл 10 мл
Решение Geltrex 1 мл 1,5 мл 4-5 мл
Dispase 0,5 мл 1 мл 3-4 мл
D-PBS для полоскания 2 мл 4 мл 10 мл

Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть приложение .

Раскрытие информации

Авторы этой статьи являются сотрудниками Life Technologies, которая производит реактивы и инструменты, используемые в этой статье.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
KnockOut DMEM/F1212660-012Примечание: см. приложение по использованию альтернативных продуктов DMEM GlutaMAX-I (кат. № 35050-061)
Заменитель сыворотки KnockOut10828-028
Коктейль факторов роста KnockOut Serum ReplacementA10580-01
FGF-basic, рекомбинантный белок человека, 10 μгPHG0024Примечание: см. приложение для ознакомления с альтернативными вариантами фасовки bFGF.
2-меркапто–этанол21985-023
Диспаза17105-041Примечание: альтернативные методы пассирования см. в приложении
Базовый матрикс Geltrex с пониженным содержанием факторов роста, пригодный для использования с чЭСК, 1 млA10480-01
Дульбекко’фосфатно-солевой буферный раствор (D-PBS) без кальция и магния14190-144
ДМСО, 500 млJT BakerJT9224-1
Стерильный бокс для культивирования тканей
Инкубатор, настроенный на 37 °C°C
электрический контроллер для пипеток
Водяная баня, установленная на 37°C°C
Стерильные серологические пипетки (5 мл, 10 мл)
Центрифуга
центрифужные пробирки объемом 15 мл
чашки для культивирования тканей диаметром 60 мм
Сосуд для хранения жидкого азота
Контейнеры с изопропанолом для заморозки
Криопробирки объемом 1,5 мл

Ссылки

  1. Takahashi, K. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  3. Yu, J. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
  4. Maherali, N. Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).
  5. Li, W. Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors. Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).
  6. Liao, J. Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells. Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).
  7. Dimos, J. T. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321, 1218-1221 (2008).
  8. Aasen, T. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).
  9. Park, I. H. Generation of human-induced pluripotent stem cells. Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Gelt TRX

Похожие статьи