Это видео демонстрирует подготовки первичных нейронов культур от midgastrula стадии эмбриона дрозофилы. Просмотров живых культур показывают клетки через 1 час после покрытия и дифференцированных нейронов после 2 дней роста бикарбоната основе определенной среде. Нейроны являются электрически возбудимыми и формы синаптических связей.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Подготовка нейронных культур от Midgastrula этапе эмбрионы дрозофилы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Это видео показывает, порядок внесения первичных нейронов культур от midgastrula стадии эмбриона дрозофилы. Методы сбора эмбрионов и их dechorionation использования отбеливателя демонстрируются. Использование стеклянной пипетки придает трубке всасывания рот, мы проиллюстрируем удаление всех клетках одного из эмбрионов. Метод диспергирования клетки от каждого embyro в небольшой (5 л) каплю среды на немелованной стекло покровное демонстрируется. Вид через микроскоп на 1 час после покрытия иллюстрирует предпочтительный плотность клеток. Большинство клеток, которые выживают при выращивании в определенной среде являются нейробластов, которые делят один или несколько раз в культуре, прежде чем предоставлять neuritic процессов 12-24 часов. Вид через микроскоп иллюстрирует уровень аксонов и ветвление ожидается в здоровую культуру в 2-х дней в лабораторных условиях. Культур выращивают в простой бикарбонат основан определенной среде, в 5% CO 2 инкубаторе при 22-24 ° С. Neuritic процессов продолжать разрабатывать в течение первой недели в культуре и, когда они делают контакт с нейритов из соседних клетках они часто образуют функциональные синаптических связей. Нейроны в этих культурах выразить напряжения закрытого натрия, кальция и калия каналов и являются электрически возбудимыми. Эта культура система полезна для изучения молекулярно-генетических и экологических факторов, которые регулируют дифференциацию нейронов, возбудимость, и формирование синапса / функцию.
Протокол
И. дрозофилы эмбрионов коллекции
- Подготовка пластин сбора яиц
- Отварите 200 мл дН 2 O с 8 г агар
- Остудить до 50 ° C
- Добавить 2 мл этанола и 2 мл уксусной кислоты
- Налейте в 35 мм пластиковые чашки Петри, топы
- Охладить и хранить в воздухе трудный контейнер при температуре 4 ° C
- Делает около 80 пластин
- Подготовка дрожжевой пасты
- Растворите Fleishmans активных выпечке дрожжи в воде с образованием пасты
- Микроволновые в течение 20-30 секунд, чтобы убить дрожжи (следите за кипит)
- Хранить в 10 мл шприца (без иглы) при 4 ° С в течение 2 недель
- Мухи: взрослые используется для сбора яиц, как правило, наиболее продуктивным от 3 до 14 дней после выхода при условии, что они имели доступ к свежей пищи. Многие мутант запасы сократились рождаемость, которая может проявляться в пониженная ставка яйценоскость и изменение возраста, в котором они могут работать наиболее продуктивно. Как правило, несколько сотен взрослых делают для хорошей яйцекладки населения.
- Процедура: Нанесите тонкий слой пасты на дрожжах пластины сбор яиц. Это обеспечивает благоприятный субстрат для укладки яиц. Передача взрослых мух в чистую бутылку сбор яиц и ленты коллекции плита в рот из бутылки. Не оставляйте мух в этих бутылках дольше, чем 3-4 часа, как влажность воздуха поднимается и мухи застревают в пасту и по бокам бутылки.
II. Эмбрион Dechorionation с Bleach
- Настройка воронке Бюхнера связаны с фильтром колбе прилагается к аспиратора. Положите кусок ватмана № 1 бумагу в воронке. При всасывании работает, мокрой бумаги стерильной дистиллированной водой.
- Промыть эмбрионы из коллекции пластин на фильтровальную бумагу с потоком воды от мытья бутылок.
- Промойте их в нескольких томах стерильной воды, выключить аспиратор, а затем добавить воронку объемом 50% гипохлоритом натрия. Давайте яйца сидеть 5-10 минут. Chorions будет распущен в течение 1-2 минут, но чем дольше вы оставите эмбрионов в отбеливатель больше загрязняющих дрожжи будут уничтожены. Выберите какую-либо взрослых или личинки, которые смываются блюдо.
- Промойте эмбрионы в стерильную чашку Петри (НЕ тканевая культура) стерильной дистиллированной водой. Многие из эмбрионов будут придерживаться дно тарелки, если он не был предварительно смачивается. Промойте несколько раз стерильной водой в этом блюде.
- Изучить эмбрионов в проходящем свете, чтобы выбрать середине гаструлы эмбрионов стадии.
III. Подготовка одного эмбриона культур
- Сделать DDM1 (см. рецепты в разделе IV)
- Налейте воду с блюдом эмбрионов непосредственно перед культивирования. Обложка эмбрионов стерильными средствами массовой информации.
- Изложить 3, 35 мм чашки Петри. Положите в 4 автоклавного круглые покровные в каждом блюде. На каждом покровное, положить 5 мкл среды. Используйте Bellco покровные низкой coverlips свинцового стекла.
Bellco Биологические Стекло
800-257-7043
Cat # 1943-00012 - Вытяните некоторые довольно тонкая пипец. Пипец мы используем, натянул Narishige PP-83 съемника. Точные размеры пипетки не решающее значение, и мы, как правило вытащить их тоньше, чем мы хотим, и разорвать их отзыв в одном поле зрения, как эмбрион, чтобы измерить размер. Вы же не хотите, чтобы высосать все из эмбрионов на одном дыхании, и ваши не хотят наконечник настолько мала, что она занимает 5 минут, чтобы поглощать клетки. Стремитесь к где-то посередине. Изучить эмбрионов в проходящем свете и использовать трубку рот всасывания придается пипетки, чтобы удалить содержимое эмбриона. Дисперсные клеток на подготовленные покровное, осторожно исключения клетки как можно ближе к покровным насколько это возможно. Вы можете хотеть рассмотреть покровные при более высокой мощности и дальнейшего разгона клеток в том же порядке.
- Пусть клетках сидят на срок не более 10 минут. Потоп блюдо со средствами массовой информации и положить в инкубатор, 4-5% СО 2 окружающей среды, при использовании определенной среде. Температура между 22-24 ° C. Мы обычно используют 23 ° С и 95% влажности. Влажность имеет важное значение, как вы хотите, чтобы избежать испарения. Вы можете использовать стандартные млекопитающих инкубаторе размещены в охлаждаемых помещений с контролем температуры установлен в 23 ° C.
IV. DDM1 определенной среде для выращивания культур
- Сделать DMEM: К 100 мл F12/DME СМИ Хэма (DMEM) (Ирвин Научно # 9052).
- Добавить 0,476 г Hepes (20 мм) (Sigma # H-3375). Mix.
- Добавить 1,25 мл L-глютамин 200 мм (Ирвин Научно # 9317). Mix.
- Фильтр в капюшон с 0,2 мкм ацетата шприц фильтр (необходимо 2 фильтра).
- РН 6,64 и Osm 288.
- Сделать аликвоты 10 мл в 15 мл пробирки центрифуги.
- Хранить при температуре 4 ° С в течение не более 2 недель.
Примечание: Всегда используйте автоклавного фильтрованную воду и сделать в контейнерах, которые зарезервированы для СМИ и дополнений только. Никогда не кладите рН электрод или мешалкой используются для других целей в Media.To сделать DDM1: Добавить добавки, перечисленные нижев DMEM незадолго до культивирования.
- К 10 мл DMEM добавить:
- 100 мкл трансферрина
- 100 мкл путресцин
- 100 мкл Селен
- 100 мкл Прогестерон
- 50 мкл инсулина
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В культурах Drosophila приготовленные из эмбрионов midgastrula этапе нейроны возникают из нейробластов предшественников, многие из которых делят до дифференциации в пробирке. Эта система обеспечивает, таким образом уникальные возможности для исследования генетических и экологических факторов, важных в очень ранней стадии развития нейронов (Rohrbaugh и соавт., 2003). Мы показали, что нейроны, выращенные в простой определенной среде дифференцироваться в электрически возбудимых нейронов, которые также формируют функциональные синаптических свя...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Эта работа была поддержана NIH грант NS27501 к DKOD. Дополнительная поддержка для этой работы из HHMI профессор Грант DKOD.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
Культур, достигнутом в этом СМИ должны поддерживаться в 5% CO2-инкубаторе при температуре около 22-24 ° C. Мы используем стандартные культуры ткани млекопитающих инкубатор помещают в холодное помещение и нагревают до 23 ° C. Всегда использовать автоклавного фильтрованную воду и сделать в контейнерах, которые зарезервированы для средств массовой информации и дополнений только. Никогда не кладите рН-метр или мешалкой используются для других целей, в средствах массовой информации.
Ссылки
- Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. Cellular bases of behavioral plasticity: Establishing and modifying synaptic circuits in the Drosophila Genetic System. J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).
- O'Dowd, D. K. Voltage-gated currents and firing properties of embryonic Drosophila neurons grown in a chemically defined medium. J. Neurobiol. 27, 113-126 (1995).
- Lee, D., O'Dowd, D. K. Fast excitatory synaptic transmission mediated by nAChR in cultured Drosophila neurons. J. Neurosci. 19, 5311-5321 (1999).
- Lee, D., O'Dowd, D. K. Cyclic-AMP-dependent plasticity at excitatory cholinergic synapses in Drosophila neurons: Alterations in the memory mutant dunce. J. Neurosci. 20, 2104-2111 (2000).
- Hodges, D. D., Lee, D., Boswell, K., Preston, C. F., Hall, L. M., O'Dowd, D. K. tipE regulates sodium-dependent repetitive firing in Drosophila neurons. Mol. Cell Neurosci. 19, 402-416 (2002).
- Lee, D., Su, H., Dowd, O., K, D. GABA receptors containing Rdl subunits mediate fast inhibitory synaptic transmission in Drosophila neurons. J. Neurosci. 23, 4625-4634 (2003).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
