Методическая статья

Применение NMDA-рецепторов в проводимости мозга крысы дофаминергических нейронов с помощью динамического Техника Clamp

13.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/2275

⸱

21 декабря 2010 г.

 , 
1Neurosciences Institute, University of Texas San Antonio - UTSA

В этой статье

Краткое содержание

В этом видео показано, как применять проводимости в дофаминергических нейронов, записанные в целом конфигурации клетки в срезах мозга крыс. Эта техника называется динамическим зажимом.

Аннотация

Нейробиологи изучают функции мозга, исследуя способы взаимодействия нейронов. Многие исследователи анализируют изменения электрической активности одного или нескольких нейронов в ответ на контролируемый в ходе эксперимента стимул. Электрическую активность нейронов в изолированных срезах мозга можно регистрировать с помощью метода патч-кламп с использованием стеклянных микропипеток. Традиционно экспериментаторы могут имитировать нейронный вход путем прямой инъекции тока через пипетку, электрической стимуляции других клеток или сохранившихся аксональных соединений в срезе, либо посредством фармакологического воздействия на рецепторы, расположенные на мембране регистрируемого нейрона.

Инъекция постоянного тока обладает такими преимуществами, как подача заданной формы волны тока с высокой временной точностью в месте записи (обычно в сому). Однако этот метод не изменяет сопротивление нейрональной мембраны, так как ионные каналы физически не открываются. При инъекции тока обычно используются прямоугольные импульсы, и таким образом она не моделирует кинетику ионных каналов. Наконец, инъекция тока не может имитировать химические изменения в клетке, которые происходят при открытии ионных каналов.

Рецепторы могут быть физически активированы с помощью электрической или фармакологической стимуляции. При электрической стимуляции среза экспериментатор может добиться высокой временной точности активации рецепторов. Однако пространственная точность активации рецепторов ограничена, и точный характер того, что именно активируется при стимуляции, остается неизвестным. Последнюю проблему можно частично решить с помощью специфических фармакологических агентов. К сожалению, временной ход активации фармакологических агентов обычно медленный, а пространственная точность воздействий на регистрируемую клетку неизвестна.

Метод динамического зажима позволяет экспериментатору изменять ток, подаваемый непосредственно в клетку, на основе обратной связи в реальном времени о мембранном потенциале клетки (Robinson and Kawai 1993, Sharp et al., 1993a,b; для обзора см. Prinz et al. 2004). Это позволяет имитировать электрические изменения, происходящие в месте регистрации в ответ на активацию рецептора. Изменения прикладываемого тока в реальном времени определяются математическим уравнением, реализованным на аппаратном уровне.

Недавно мы использовали метод динамического зажима для изучения генерации пачек потенциалов действия при фазической активации NMDA-рецепторов в дофаминергических нейронах компактной части черной субстанции (Deister et al., 2009; Lobb et al., 2010). В данном видео мы демонстрируем процедуры, необходимые для моделирования проводимости NMDA-рецепторов в дофаминергическом нейроне.

Протокол

1. Подготовка фрагментов

  1. Вырезать мозга ломтиками использованием вибрирующей микротоме. Мы подготовили 240 мкм горизонтальных срезов мозга от ИФ-anethetized Sprague-Dawley крыс (Charles River Laboratories) использованием вибрирующей микротома (Microm HM 650V) в соответствии с Техасского университета в Сан-Антонио Институциональные уходу и использованию животных комитета.
  2. Держите ломтики в камере инкубации пока не будете готовы к записи. Мы используем инкубационный контейнер нагревается до 32 ° C и наполнен искусственной цереброспинальной жидкости (aCSF; в мм): 126 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 4 2 MgCl 2, CaCl 2, 10 декстрозы, 25 NaHCO 3, 1,3 аскорбиновой кислоты, 2,4 пируват натрия и 0,05 глутатиона.

2. Электрофизиологические Запись

  1. Передача квант внутриклеточных установки записи, в которых искусственным спинномозговой жидкости (aCSF) при 35 ° C в настоящее время перфузии. Мы используем те же aCSF как и в 1,2 исключением того, что 2 мМ MgCl 2 был использован и глутатион был опущен. Для горизонтально подготовленные ломтики, которые мы обычно делят пополам ломтик вдоль средней линии.
  2. Визуализируйте цель нейрона. Мы визуализировать отдельные черной субстанции дофаминергических нейронов с изображениями система отличие градиент.
  3. Вытяните электрода с помощью электронной съемник электрода. Тянем электродами с наконечником сопротивлением 4-10 МОм использованием P97 микропипетки съемник (Саттер Instrument Company).
  4. Заполнить электрод с желаемой внутреннее решение. Мы используем раствор, содержащий (в мм): 138 К-глюконат, 10 HEPES, 2 MgCl 2, 0,2 EGTA, 0.0001 2 CaCl, 4 Na-АТФ, 0,4 Na-GTP. Внутренние раствора доводили до рН 7,3 использованием 1М КОН и осмолярность 270-275 mOsms.
  5. Сделать gigaohm печать на нужный нейрон. Разрыв печать с всасывания. В этом заключается весь записи клетки. Усилитель Multiclamp 700B был использован в нашей конфигурации. Усилитель должен быть помещен в текущем режиме зажим 'I = 0'.

3. Проводимость приложения с динамической Clamp

  1. RTXI (www.rtxi.org) был выполнен на компьютере динамическую зажимом. Пользовательских письменного модели, содержащей NMDA-рецепторов был загружен в память. Тока, вводят в клетку в реальном времени рассчитывается по следующей формуле:
    Я NMDA =-г NMDA * [1 / (1 ​​+ ([Mg] / 3,57) * е (-V м * 0,062))] * (V м - E NMDA), где г NMDA является искомой проводимости (в нс; По умолчанию установлено в 0 нс), [Mg] является концентрация магния (устанавливается до 1,5 мм в нашем примере ниже), E NMDA есть потенциал реверсии для NMDA-рецепторов (установлен в 0 мВ) и V м мембранный потенциал ячейки измеряется от усилителя (в милливольтах).
  2. Вывод динамических компьютер зажим был подключен к командной вход усилителя через аналого-цифровой преобразователь.
  3. Усилитель был помещен в текущем режиме зажим 'IC'.
  4. Введите желаемый NMDA рецепторов проводимости в RTXI (например 40nS). Вы должны увидеть фазовый взрыв потенциалов действия. Кроме того, проводимость может быть предоставлена ​​RTXI через аналоговый выход (рис. 1А, "г (т) '). Соответствующий коэффициент масштабирования следует использовать в течение RTXI для преобразования сигнала от вольт для Siemens.

4. Представитель Результаты

Успешной установки для применения проводимости с помощью динамического зажима показан на рисунке 1а. С помощью этой установки, мы сделали все соматической клетки записи с дофаминергических нейронов в черной субстанции Парс компактов. Дофаминергической клетки обычно спонтанно огонь по низким ценам с кардиостимулятором, как шаблон. Взрыв потенциалы действия могут быть вызваны фазовыми применения NMDA-рецепторов проводимости с динамическим зажим (рис. 1В).

Рисунок 1
Рисунок 1: Применение NMDA-рецепторов проводимости с помощью динамического техника зажима. А. Аппаратное обеспечение иллюстрирующие связь между внутриклеточными установки записи и динамических компьютер зажимом. Б. взрыв потенциалов действия вызывается путем применения 40nS NMDA-рецепторов проводимость в целом запись клетки от черной субстанции Парс компактов дофаминергических нейронов.

Обсуждение

Динамический метод зажима продемонстрировали здесь улучшает традиционную технику постоянного тока инъекции, позволяя экспериментатором, чтобы имитировать электрических эффектов активации рецептора. В этом видео, мы показали, что можно добавить эффекты активации NMDA-рецепторов к спонтанной активности дофаминергических нейронов, то есть взрыв потенциалов действия вызываются.

Благодаря гибкости аппаратной / программной реализации, различные расширения могут быть использованы. Знак вводится ток может быть включен с отрицательного на положительный, что составляет сценарий, при котором эффекты активированного рецептора удаляется из нейрона. Модель нейронов, представить в виде серии дифференциальных уравнений, также может быть решена численно и позволяет экспериментатору для исследования малых сетей.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Эта работа была поддержана MH084494 (CJL), а MH079276 и NS060658 (CAP).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
K-глюконат безводныйРеагентSigma-Aldrich
HEPESРеагентFisher Scientific
CaCl2 X 2H2OРеагентFisher Scientific
Этиленгликоль-бис(β-амино–этиловый эфир)-N,N,N’,N’-тетрауксусная кислотаРеагентSigma-Aldrich
MgATPРеагентMP Biomedicals
NaGTPРеагентMP Biomedicals
MgCl2РеагентSigma-Aldrich
NaHCO3РеагентSigma-Aldrich
KClРеагентFisher Scientific
NaH2PO4, безводныйРеагентFisher Scientific
ГлюкозаРеагентAcros Organics
NaClРеагентFisher Scientific
CholClРеагентSigma-Aldrich
Пируват натрияРеагентFisher Scientific
Аскорбиновая кислотаРеагентAcros Organics
ГлутатионРеагентSigma-Aldrich
Микроскоп Olympus BX51WI (с объективом 40x)МикроскопOlympus Corporation
2 АЦП-преобразователяОборудованиеЛюбой поставщик
Multiclamp 700B с головным модулем CV-7BОборудованиеMolecular Devices
Пульлер микропипеток P-97 Flaming/BrownОборудованиеSutter Instrument Co.
Иглы для шприцев MicrofilОборудованиеWorld Precision Instruments, Inc.
МикроманипуляторОборудованиеSiskiyou, Inc.
МониторОборудованиеTriview

Ссылки

  1. Robinson, H. P., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. J Neurosci Methods. 49, 157-165 (1993).
  2. Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons. Trends Neurosci. 16, 389-394 (1993).
  3. Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. J Neurophysiol. 69, 992-995 (1993).
  4. Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp comes of age. Trends Neurosci. 27, 218-224 (2004).
  5. Deister, C. A., Teagarden, M. A., Wilson, C. J., Paladini, C. A. An intrinsic neuronal oscillator underlies dopaminergic neuron bursting. J Neurosci. 29, 15888-15897 (2009).
  6. Lobb, C. J., Wilson, C. J., Paladini, C. A. A dynamic role for GABA receptors on the firing pattern of midbrain dopaminergic neurons. J Neurophysiol. 104, 403-413 (2010).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

patch clampAxo Graph X

Похожие статьи