3-D структура молекулы дает уникальное понимание того, как функции молекулы. Основным методом определения структуры в ближнем атомное разрешение рентгеновской кристаллографии. Здесь мы демонстрируем, современные методы получения трехмерных кристаллов любой макромолекулы, которые подходят для определения структуры методом рентгеновской кристаллографии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Кристаллизации белков для рентгеновской кристаллографии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Использование трехмерной структуры биологических макромолекул сделать вывод, как они функционируют является одним из важнейших направлений современной биологии. Наличие атомных структур разрешение обеспечивает глубокое и уникальное понимание функции белка, и помогает раскрыть внутренние механизмы живой клетки. На сегодняшний день 86% Protein Data Bank (rcsb-PDB) записи макромолекулярных структур, которые были определены с помощью рентгеновской кристаллографии.
Для получения кристаллов подходит для кристаллографических исследований, макромолекулы (например, белки, нуклеиновые кислоты, белок-белкового комплекса или белково-нуклеиновых кислот комплекса) должны быть очищены до гомогенного состояния, или как можно ближе к однородности. Однородности подготовки является ключевым фактором в получении кристаллы, которые преломляют с высоким разрешением (Bergfors, 1999; Макферсон, 1999).
Кристаллизация требует приведения макромолекулы пересыщения. Выборка должна быть сосредоточена в максимально возможной концентрации, не вызывая агрегации или осаждения макромолекулы (обычно 2-50 мг / мл). Введение образца осадителя может способствовать зарождению кристаллов белка в решение, которое может привести к большим трехмерным выращивания кристаллов из раствора. Есть два основных метода получения кристаллов: диффузии пара и пакетного кристаллизации. В диффузии водяного пара, капли, содержащие смесь осадителя и белковых растворов запечатывается в камере с чистой осадителя. Водяной пар затем диффундирует из падают осмолярность падение и осадителя равны (рис. 1А). Обезвоживания падение причины медленного концентрации белка и осадителя, пока равновесие достигается, в идеале в кристалле зоне зарождения фазовой диаграммы. Партия метод основан на ввоз белок непосредственно в зоне зарождения, смешивая белки с соответствующим количеством осадителя (рис. 1В). Этот метод обычно проводится под парафином / смесь минерального масла, чтобы предотвратить распространение воды из капли.
Здесь мы покажем два вида экспериментальной установки для диффузии пара, висячей капли и, сидя капли, в дополнение к партии кристаллизации в масле.
Протокол
Материалы по теме:
- Белки образца - лизоцима (50 мг / мл)
- Висячие падение 24-а лоток
- Сидя падение 24-а лоток
- Microbatch кристаллизации 96 и лоток
- Кристаллизация решений (как коммерческих, в наличии или домашний)
- Силиконовая смазка
- 5 мл шприц без Луер-Лок
- Силиконизированный слайды крышкой
- Оптический уплотнительная лента
- Парафин
- 0.1-2 мкл микропипетки с низким уровнем удержания советы
- Пинцет
- Профессиональные салфетки
1. Висячие / сидя удалить процедуру:
- Для начального экрана можно использовать ком....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Кристаллизацию обычно называют «узким местом» рентгеновской кристаллографии. Скрининг условий осаждения методом разреженной матрицы с неполным факториалом обычно приводит к возникновению многих различных типов агрегации и осаждения белков, среди которых встречаются крупные монокристаллы. Если концентрации белка или осадителя слишком высоки, можно наблюдать коричневую массу без определенной формы и размера (аморфное осаждение). В случае недонасыщения раствора капля часто остается полностью прозрачной и лишенной каких-либо.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этой статье мы расскажем и продемонстрировать общие текущие протоколы для кристаллизации белков. Так как это многоступенчатая процедура Есть несколько соображений, нужно быть в курсе. При работе с очень малых объемах (0,5-2 мкл), сушки капли за счет испарения является основной проблемой. Следовательно, рекомендуется для работы в хорошо контролируемых условиях (с низким потоком воздуха, высокая влажность и жесткий контроль температуры) и принять метод, который сводит к минимуму воздействие снизится до открытом воздухе........
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Эта работа была поддержана следователь Burroughs Wellcome награду Ю.М. и Brown-Кокс Докторантура стипендий из Йельского университета Мэриленд.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Лизоцим | Sigma-aldrich | L6876-1G | |
| 24-луночный планшет VDX | Hampton research | HR3-142 | |
| 24-луночный планшет Cryschem | Hampton research | HR3-158 | |
| Вакуумная смазка Dow Corning | Hampton research | HR3-510 | |
| Силиконизированные круглые покровные стекла | Hampton research | HR3-231 | |
| 100% парафиновое масло | Hampton research | HR3-411 | |
| Прозрачная герметизирующая лента Crystal Clear шириной 1.88 inch | Hampton research | HR3-511 | |
| 96-луночный планшет Imp@ct (планшет для микропартий) | Hampton research | HR3-098 |
Ссылки
- Bergfors, T. M. Protein crystallization : techniques, strategies, and tips : a laboratory manual. , International University Line. La Jolla, Calif. (1999).
- Carter, C. W., Carter, C. W. Protein crystallization using incomplete factorial experiments. J Biol Chem. 254....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
