Введение в Worm Лабораторная работа: от культивирования червей для мутагенеза

Краткое содержание

Скрининг на мутантов с фенотипическими дефектов простой метод для выявления генов, которые функционируют в данный биологический процесс. В этой статье мы опишем, как культура свободного червей жизни (например, Pristionchus расШсиз) В лабораторных и показывают два различных метода мутагенеза, EMS и TMP / UV.

Аннотация

Этот протокол описывает процедуры для поддержания нематод в лаборатории и, как mutagenize их с помощью двух альтернативных способов: этиловый сульфонат метана (EMS) и 4, 5, 8-trimethylpsoralen в сочетании с ультрафиолетовым светом (TMP / UV). Нематоды являются мощными биологическими системами для ДНК-исследований из-за их простой план тела и система скрещивания, в состав которого входят самооплодотворяющимися гермафродиты и мужчин, которые могут генерировать сотни потомства на одно животное. Нематоды ведутся в агара чашки, содержащие газон бактерий и могут быть легко перенесены из одной пластины к другой, используя выбор. EMS является алкилирующего агента обычно используется, чтобы вызвать точечные мутации и малых удалений, в то время как TMP / UV основном вызывает удалений. В зависимости от вида нематод используются, концентрации EMS и TMP должны быть оптимизированы. Чтобы изолировать рецессивных мутаций расШсиз нематоды Pristionchus, животные F2 поколения были визуально обследование на фенотипы. Для иллюстрации этих методов мы мутагенизированных червей и искали Несогласованные (UNC), унылый (DPY) и трансформатор (TRA) мутантов.

Протокол

Часть 1: Подготовка нематоды питательной среды (НГО) чашки Петри

Экспериментальные нематод, таких как С. Элеганс и П. расШсиз, как правило, культивируют в лаборатории на 6 см чашках Петри содержащие нематода Рост средний (НГО) ^1. Черви хранятся при температуре 20 ° C, но может быть инкубировали при диапазоне температур (от 4 ° C - 25 ° С), в зависимости от видов нематод и экспериментального проектирования. Для подготовки пластин с НГО, стандартные стерильные методы должны быть использованы, чтобы предотвратить грибковые и бактериальные загрязнения. Ниже приводится протокол для подготовки NGM плит:

1. Взвесьте 15 г агара, 2,4 г NaCl, 2 г триптон, и 2,72 г KH ₂ PO ₄ в 2 л коническую колбу, чтобы объем до 1 л воды, автоклав и дайте ему остыть до 60 ° С на водяной бане.
2. Добавить 0,8 мл 1 М CaCl _2, холестерина (5 мг / мл в этаноле), и 1 М MgSO _4. Для профилактики грибковых и бактериальных загрязнений, 1 мл стрептомицина (100 мг / мл) и 1 мл нистатина (10 мг / мл) могут быть добавлены в каждый литр среды.
3. Использование Unispense машины и поддержания стерильных условиях, залить средств массовой информации в нужное пластин. Плиты должны быть заполнен на 2 / ^3-й полном объеме. Стандартным диаметром 60 мм пластины требуется около 10 мл СМИ. Не перемещайте пластин до агар полностью gelified, в противном случае будет неровной поверхности агара, что делает ее трудно сосредоточиться червей на стереомикроскопа.
4. После высыхания плиты могут быть посеяны сразу или хранить при температуре 4 ° С до посева с бактериями.

Часть 2: Подготовка OP50 бактерий и посева NGM чашки Петри

П. расШсиз выращиваются в лабораторных условиях, питаясь штамма E.coli OP50. OP50 имеет ограниченный рост на NGM пластины, тем самым образуя тонкую газон, который облегчает визуализацию червей ^1. Чтобы вырастить культуру OP50, используйте LB-бульон:

1. Добавить 5 г bactotryptone, 2,5 г дрожжевого экстракта и 2,5 г NaCl в 500 мл флакон крышкой, составляют объем до 500 мл дистиллированной воды и автоклав.
2. Привить бульон с одной колонии OP50 от культуры пластины в стерильных условиях, и пусть она растет в течение ночи при температуре 37 ° C.
3. LB-OP50 готова для использования и может храниться при температуре 4 ° С в течение нескольких месяцев, если стерильность сохраняется. Всякий раз, когда пластины должны быть посеяны, залить небольшим количеством бульона в небольшую стерильную мензурку, и это поможет предотвратить загрязнение фондовом культуры.
4. Для семян плиты, отказаться от 100-120 мкл OP50 на 60 мм в диаметре NGM Петри пластине и вихревые распространять его.
5. Инкубируйте эти посеяны пластин в течение ночи при комнатной температуре в течение газон расти. Эти отобранные пластин теперь можно хранить при температуре 4 ° С в течение 3 недель. Хранение их в перевернутом положении помогает предотвратить быстрое высыхание.

Часть 3: Создание выбрать

В этом разделе мы опишем, как сделать выбор для червей. Выбрать используется для передачи червей из одного места в другое. Выбрать состоит из 30 калибр 90% платины 10% иридия проволоки, хотя некоторые исследователи предпочитают несколько различных композиций из металла:

1. Отрежьте около 3-4 см провода, место 0,5 см внутрь кончиком пипетки Пастера (вершина которого была нарушена в меньшей длины), а затем запечатать его в стекло над горелкой Бунзена. Длина провода торчащие из стекла составляет около 3-3,5 см, но может меняться в зависимости от индивидуальных предпочтений.
2. Свести конце провода, выступающие с помощью молотка или плоскогубцами. Затем согните вверх уплощенная часть для формирования совок.
3. Сглаживание острых краев забрать с наждачной бумагой, чтобы предотвратить повреждение червя или агар.

Часть 4: Выбор червей

1. Чтобы выбрать червей, стерилизовать платиновой проволоки на пламени и перетащите плоский кончик подобрать по бактериальным газоном, чтобы покрыть наконечник с толстым липким бактерий, заботясь, чтобы не прокола или повреждения поверхности агара.
2. Использование стереомикроскопа, очень легко чистить липкий кончик против червя / червей, чтобы ее взяли, пока червь палочки на бактерии на выбор.
3. Как только червь на кончике забрать, передать его непосредственно к новой пластинкой, касаясь или раздвижные кончик поднять против бактериального газона новой пластинки, и червь должны расползаться. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не повредить поверхность агара на тарелке еще червей ползать в отверстия, что затрудняет для их извлечения. Если червь остается на выбор слишком долго, он может высыхать.

Часть 5: EMS мутагенеза

Этиловый метан сульфонат (EMS) индуцирует широкий спектр мутаций в геноме 2. Мутанты могут быть идентифицированы как дефекты кладки, мышечные дефектыс, определение пола, Dauer образование, поведение и гонады образования. Протокол EMS мутагенеза, аналогичный описанному для C. Элеганс ^1.

1. Подготовка 500 мл (или более) 1 н NaOH.
2. Возьмите 4-5, 6 см в диаметре чашки Петри с червями, содержащих несколько сотен червей на третьей личиночной несовершеннолетних (J3) этапа и мыть червей с использованием 2-3 мл стерильного M9 на чашку.
3. Соберите все черви в стерильные, одноразовые трубки центрифуги 15 мл. Центрифуга на 1500 мкг в течение 5-7 минут или до червей форме гранул.
4. Аспирацию жидкости и использовать 2 мл M9 повторно приостанавливать червей. Добавьте 20 мкл EMS для трубки, содержащей 2 мл M9 и потрясите, чтобы растворить его. Затем добавить это решение EMS к 2 мл суспензии червя и водоворот мягко. Конечная концентрация EMS будет 47 мм. Внимание: EMS является очень сильным мутагенным и должны быть обработаны в вытяжном шкафу. Все материалы (перчатки, пипетки, советы), которые вступают в контакт с этой мутаген следует относиться с 1N NaOH до неактивных EMS. Одежда двойных перчаток во время всей процедуры мутагенеза EMS. Утилизация опасных отходов в соответствии с руководящими принципами вашей организации.
5. Место центрифужную пробирку и покрывают крышкой с парафильмом; поместите его горизонтально в вытяжной шкаф и пусть червей инкубировать в течение 3,5 часов. Трубка может быть размещен на низкой скорости рокер.
6. Включите трубки и покрывают крышкой с парафильмом; место в вертикальное положение и инкубировать до раковины червей.
7. Аспирируйте супернатант и выбросить его в стакан / колбу 1N NaOH. Это инактивирует EMS.
8. Добавьте 5 мл M9 для червей, инвертировать трубки 25-30 раз мыть червей, центрифуге при 1500 мкг в течение 5-7 минут или пока черви форме гранул. Аспирируйте супернатант и выбросить в 1N NaOH стакан.
9. Повторите промывание шаг по крайней мере 3 раза.
10. После последней промывки, вновь приостановить червь осадок в минимальном количестве (~ 500 мкл) M9 и пипетки их на NGM чашки, содержащие газон OP50 бактерий. В этот момент вам больше не нужно работать в химической капотом.
11. Пусть жидкость высохнуть в течение нескольких минут, а затем выбрать и передачи здоровый J4 личинок на свежий пластинами заполнена. Откажитесь от оригинальной пластины в соответствии с руководящими принципами опасных вашей организации отходов.
12. Позвольте себе мутагенизированных червей оплодотворению. Использование стереомикроскопа, экран F2 фенотипы поколения для рецессивных мутантов интересов.

Часть 6: Psoralen мутагенеза

В этом разделе мы опишем процедуру использования мутагенеза TMP в сочетании с длинной волны ультрафиолетового (УФ). TMP / УФ методом мутагенеза широко используется, чтобы вызвать исключение мутаций в геноме ^3.

1. Сбор червей от 4-5, 6 см в диаметре чашках Петри в 15 мл центрифужную пробирку, как описано в предыдущей процедуре.
2. Добавьте 10 мл M9, инвертировать 20 раз мыть червей и центрифуге при 1500 мкг в течение 5 минут. Удалите супернатант и повторите мытье в общей сложности 3 раза. Аспирацию жидкости и вновь приостановить червей примерно в 10 раз больше объема M9, содержащей 30 мкг / мл TMP. Внесите 20 мкл TMP (3 мг / мл) в 2 мл M9. Как EMS, TMP является канцерогеном и должна обрабатываться принятия надлежащих мер безопасности. Для предотвращения потенциального риска ультрафиолет надлежащего глаз носит должен быть использован. Одноразовых должны быть уничтожены в надлежащем биологической сумки.
3. Инкубируйте пробирку в темноте в течение 15 минут при комнатной температуре на низкой скорости рокер (40 ОНД). Установить покрыта труба вертикально в течение 10 минут, чтобы все черви раковину.
4. Удалить червей из нижней части трубки с пипетки Пастера и передачи их на unseeded пластины NGM. Удалите надосадочную следующих опасных принципов вашей организации химических веществ.
5. Храните пластины в темноте, пока избыток TMP всасывается в тарелку.
6. Использование УФ-метр интенсивности, установить расстояние между длинными источника УФ-волны и пластинка так, что интенсивность на пластину составляет 500 мкВт / см ^{2 4.} Снимите крышку алюминия и крышки и крышки и разоблачить пластины, содержащей TMP лечение червей долго УФ излучение в течение 50 секунд.
7. Накрыть и оставить червей в темноте в течение 5 часов при комнатной температуре.
8. Комплектование и передача здоровый J4 личинок на свежий пластинами заполнена. Откажитесь от оригинальной пластины следующих опасных принципов вашей организации химических веществ.
9. Использование стереомикроскопа, экран F2 фенотипы поколения для мутации интерес.

Часть 7: Представитель Результаты

Некоторые из P. расШсиз мутант фенотипы в результате мутагенеза (либо EMS или TMP / UV), показаны на рисунке 1. Каждый мутант имеет характерный фенотип, который легко отличимы от дикого животного типа. От червей, которые лечили мутаген, 30 J3/J4 личинок из родительского поколения (P0) были помещены в отдельные тарелки и позволили, чтобы отложить яйца, которые поколения F1. Из пластин, которые показали, здорового потомства F1, в общей сложности 1000 F1s были переведены на отдельные тарелки и F2 потомства был показан на фенотипы. Животные с унылый ^5,6, Нескоординированные ⁶ и ⁷ Трансформатор фенотипы были найдены.

Рисунок 1. Pristionchus расШсиз дикого типа и мутантных животных. А. Б. вес гермафродит вес мужчин С. Д. DPY мутант UNC-мутанта E. тра мутанта. Top две панели показывает дикого типа гермафродит (слева) и самца (справа) животных для сравнения с различными мутантами в остальных панелей.

Обсуждение

Мутагенеза является широко применяется методика генетических исследований в различных экспериментальных модельных организмов. Мутагенез эксперименты часто используется для определения функций генов ^2. Мутагенеза процедур, описанных здесь, может использоваться не только для P. расШсиз, но и для С. Элеганс и других связанных с ними видов нематод. Здесь мы опишем два метода, EMS и TMP / УФ-мутагенеза.

EMS является химическое вещество, которое вызывает точечные мутац...