Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Summary

Обратные генетические подходы оказались чрезвычайно полезными для определения того, какие гены лежащие в основе сопротивления вектора патогенов в комаров. Это видео показывает протокол метод, используемый Dimopoulos лаборатории, чтобы придать дсРНК в Anopheles gambiae комары, которые гавани малярийного паразита. Техника манипуляций инъекции установки и инъекционных дсРНК в грудной клетки показано на рисунке.

Abstract

Обратные генетические подходы оказались чрезвычайно полезными для определения того, какие гены лежащие в основе сопротивления вектора патогенов в комаров. Это видео показывает протокол метод, используемый Dimopoulos лаборатории, чтобы придать дсРНК в Anopheles gambiae комары, которые гавани малярийного паразита. Техника манипуляций инъекции установки и инъекционных дсРНК в грудной клетки показано на рисунке.

Protocol

RNAi-опосредованной генов в комары требует предварительной подготовки и очистки конкретных dsRNAs этой цели гена. Для синтеза дсРНК, мы рекомендуем комплект Амбион Megascript которая использует Т7 РНК-полимеразы-опосредованной реакции в пробирке транскрипции. Для очистки дсРНК, мы рекомендуем комплект Qiagen RNeasy. Образцы дсРНК должна быть количественно и доводили до 3 мкг / мкл в воде. Другие материалы, которые вы должны включать: острым концом щипцов, стекло, стекло микрокапиллярных иглы, microinjector (мы используем Драммонда Nanoject II), световой микроскоп установлены над холодный блок, покрытый стеклянной чашки Петри, бумажные полотенца и ведро льда . Вам также понадобится способ сбора комаров и подходящий контейнер для их вместе с источником питания, таких как хлопок шарик, пропитанный в 10% сахарозы.

1. Соберите свою комаров. Использование батарейках аспиратор, собирать комаров вы хотите внедрить. Подключите сопло с бумажным полотенцем или хлопка так что никаких комаров может уйти и снять водохранилища. С холодным температурам обезболить комаров, похоронить водохранилища в ведро льда и подождите 5-10 минут для комаров, чтобы остановить движение. Обезболивание может быть достигнуто путем размещения водохранилища в холодное помещение или холодильник или с помощью CO _2. За эти 5-10 минут, переходите к следующему шагу.
   
   
2. Подготовка рабочего места. Установите плоскую поверхность холодного блока до 2 ° С и поместить стекло на ней. Это где комары будут отдыхать, как Вы вводите их. Приложите стекло иглой на microinjector и использовать щипцы сломать кончик иглы до нужной ширины. Важно, чтобы ширина достаточно велик, чтобы позволить достаточно места для жидкости течь через по разумной ставке, но узкими, чтобы нанести минимальный рану во время инъекции. Хороший наконечник иглы будет достаточно узким, чтобы согнуть немного, но не ломаются. Установите инъекций до желаемого объема производства (для РНК-интерференции, мы используем 69 NL). Погрузите кончик иглы в ваш образец и обратить ваше жидкого образца в иглу согласно инструкции производителя. Жидкого образца может быть решением дсРНК, бактериальной суспензии или других; инъекции процесс одинаков для всех. Добавить стеклянном блюде Петри в ведерко со льдом, так что дно тарелки полностью контакта льда. Это где вы поставите комаров пока вы не готовы внедрить их.
   
   
3. Подготовьте свой ​​комаров. Передача 50-100 комаров из резервуара в стеклянном блюде Петри. Используйте пинцет, чтобы тонкие их в один слой, убедившись, что большинство из них контакт с холодной дно тарелки, чтобы держать их под наркозом. Обложка этих комаров с блюда крышку, когда он не используется. Возвращение резервуара ведерко со льдом, чтобы сохранить остальные комаров наркозом.
   
   
4. Горы комаров на холодный блок. Используйте свой острым концом щипцов для передачи комаров по одному от блюдо, чтобы стекло монтируется на холодный блок под световым микроскопом. Ручка комаров осторожно, желательно к ногам. Выстроить столько, сколько 30 комаров бок о бок на слайде, убедившись, что вы можете получить на каждый из них с microinjector и убедившись, что каждый вступает в контакт с холодным слайда. Убедитесь, что комары выстроены упорядоченно, так что, как Вы продвигаетесь вы знаете, какой есть, и которые не были введены. Оставьте других комаров покрыты охлажденное блюдо Петри.
   
   
5. Inject вашей первой группы комаров. Держите с острым концом наконечником пинцетом в одной руке и удерживайте microinjector в другой руке, как карандаш. Используйте пинцет для перемещения комаров, сколько вам нужно (обрабатывать их за ноги, чтобы не пораниться) и сохранить устойчивый комар, как Вы вводите. Это работает лучше всего, если вы используете щипцы для поддержки одной из сторон комара, как Вы вводите с другой стороны. Осторожно вставьте только кончик иглы в грудной клетке комара. Лучше всего, чтобы впрыснуть в тугой еще тонкая часть кутикулы, чтобы минимизировать травмы. Кроме того, избегайте инъекционных слишком глубоко, вы хотите только верхушка быть внутри грудной клетки, глубже инъекции приводят к большей ран, которые поставят под угрозу выживание. Как только кончик иглы находится в положении, нажмите и отпустите педаль аппарата microinjector который доставит ваш заданного объема дсРНК. Подождите одну-две секунды и удалить иглу от комаров. Если капля жидкости выходит за пределы раны, подождите несколько секунд для того, чтобы быть поглощенными в рану. Если он не впитывает в течение нескольких секунд, отбросить, что комар и повторите попытку. Продолжить процесса впрыска для всех комаров на стекле.
   
   
6. Храните комаров. Когда вы закончите, поместите вводят комаров внутри маркированные контейнеры (мы предпочитаем 1 пинта вощеной картонные стаканы покрытыСетка сетки и обеспеченных резинками и картона крышки).
   
   
7. Продолжить инъекции пока не закончено. Продолжайте место комаров на слайде, вводить и трансфер в чашки, пока вы не размер выборки вы желаете. Счет для некоторых смерть начинающих будет много комаров умирают от травм инъекции. Это позволит улучшить с практикой почти до 100% вашего комары выживают инъекции.
   
   
8. Когда закончите, место сложенным, влажное бумажное полотенце за чашку вместе с источником питания и крышки стакана с чем-то удерживать влагу, таких как полиэтиленовой пленкой или пластиковой крышкой Петри. Введенный комаров склонны к высыханию так влаги осуществляется мокрым полотенцем и хранится у пластиковых поможет не допустить этого.
   
   
9. Наведите комаров в экологически контролируемой камеры для инкубации.

Примечание: Эффективность генов сильно варьирует и зависит от ряда факторов, включая стенограммы и белка оборот ставок, а дсРНК эффективность поглощения клетками и органами. Мы обнаружили, что глушителей начинается уже с 1 инъекцию сообщению день, и может длиться до 6 инъекций сообщение дней. Используйте запись и белка методов обнаружения, таких как количественный ПЦР и Вестерн-блоттинга для проверки глушителей.

Примечание: Есть несколько вариаций на несколько шагов от комаров впрыска и RNAi-опосредованной генов техники. Некоторые изменения описываются: Буассон, и др. (2006) и Бландена, и др. (2002)…

Discussion

Эффективность генов сильно варьирует и зависит от ряда факторов, включая стенограммы и белка оборот ставок, а дсРНК эффективность поглощения клетками и органами. Мы обнаружили, что глушитель начинает уже через 1 день после инъекции и может длиться до 6 инъекций сообщение дней. Используйте запись и белка методов обнаружения, таких как количественный ПЦР и Вестерн-блоттинга для проверки глушителей.

Materials

Megascript	kit	Ambion		for dsRNA synthesis; T7 RNA polymerase-mediated in vitro transcription reaction
RNeasy		Qiagen		For dsRNA purification
dsRNA				should be quantified and adjusted to 3 μg/ μL in water
fine-tipped forceps
glass slide
glass microcapillary needles
microinjector		Drummond Scientific	Nanoject II
light microscope				mounted above a cold block
Petri dish				covered, glass
paper towels
10% sucrose	food
A. gambiae	Animal			mosquitos