Сочетание Клей-ленты на основе выборки и флуоресценции На месте Гибридизация для быстрого обнаружения Сальмонеллы На Fresh Produce

Краткое содержание

Этот протокол описывает простую клей-ленты на основе подход к отбору проб из помидоров и другой свежей поверхности продукции, с последующим быстрым целом обнаружения ячейки Сальмонеллы С помощью флуоресцентной На месте Гибридизации (FISH).

Аннотация

Этот протокол описывает простой подход для клея-ленты на основе выборки из помидоров и других свежих поверхностей производят, а затем на ленту флуоресценции в гибридизация (FISH) для быстрого культуры независимой обнаружения бактерии рода сальмонелла. Сотовые заряженные ленты могут также быть помещены лицевой стороной вниз на селективном агаре для твердофазной обогащения до обнаружения. Кроме того, низкие объемы жидкости обогащения (жидкие miniculture поверхности) могут быть выполнены на поверхности ленты в неселективных бульон, а затем FISH и анализ с помощью проточной цитометрии. Во-первых, стерильные клейкой ленты приводят в контакт со свежими продуктами, нежное давление применяется, и лента удаляется, физически извлечения микробы присутствуют на этих поверхностях. Ленты крепятся липкой стороной вверх на предметные стекла микроскопа и стекла пробы клетки фиксировали 10%-ного формалина (30 мин) и обезвоженной использованием градуированных серии этаноле (50, 80 и 95%; 3 мин каждой концентрации). Затем клетка заряженные ленты пятнистый с буфером, содержащим Salmonella ориентированных коктейль ДНК-зонда и гибридизовали в течение 15 - 30 мин при 55 ° С с последующим кратким полоскания в стиральной буфера для удаления несвязанного зонда. Приверженец, FISH-меченых клеток, затем контрастно с ДНК красителя 4 ',6-diamidino-2-фенилиндола (DAPI), а результаты просматривать с помощью флуоресцентной микроскопии. Для твердой фазы обогащения, сотовые заряженные ленты расположены лицевой стороной вниз на подходящей поверхности селективного агара и инкубировали, чтобы на месте рост сальмонелл микроколоний, а затем FISH и микроскопии, как описано выше. Для жидких miniculture поверхности клеточной взимается ленты размещены липкой стороной вверх и камеры силиконовые перфузии применяется таким образом, чтобы лента и стекло микроскопа форма нижней части водонепроницаемую камеру, в которой малый объем (≤ 500 мкл) Trypticase Соевый Отвар (БСЭ) вводится. Впускные отверстия герметизируются и камер инкубируют при 35 - 37 ° C, что позволяет на основе роста усиления ленты экстрагировали микробов. После инкубации, впускные порты распечатал, клетки отделяются и смешивается с энергичным и обратно пипетки, собранных с помощью центрифугирования и фиксировали в 10% нейтральный буферный формалин. Наконец, образцы гибридизированных и исследовали с помощью проточной цитометрии выявить наличие бактерии рода сальмонелла. Как описано здесь, наш «Лента-FISH" подход может обеспечить простой и быстрый отбора проб и обнаружения сальмонеллы в томатном поверхностей. Кроме того, мы использовали этот подход для отбора проб другие виды свежих продуктов, включая шпинат и халапеньо перец.

Протокол

1. Поверхность выборки с Стерильные клейкая лента

1. Выберите ленту использовать для отбора проб. Имеющихся в продаже грибов-Tape или контакт-It выборки ленты стерильные и специально упакованы для простоты использования. Тем не менее, мы обнаружили, что прозрачный (оптически прозрачный) общие ленты офиса может также использоваться.
2. Используйте маркер, чтобы нарисовать 1 см ^{2 площади} на нелипкую стороной 10 см кусок клейкой ленты (бумажный шаблон может использоваться). Это будет служить руководством для визуального отметить, какая часть ленты была использована для образцов пищи или окружающей среды поверхности.
3. Форма "С"-образная петля ленты, с липкой стороной к поверхности, чтобы быть в выборку. Для этого, удерживая липкие концы с большого и среднего пальца и положение указательного пальца против обращается квадрат на спине (не клейкой стороной) на кассету (рис. 1).
4. Место ленты на поверхность, чтобы быть отобраны и слегка нажмите выделенную область на поверхность. Не отпуская края ленты, используйте указательный палец, чтобы липкая сторона ленты происходит в полном контакте с поверхностью образца, избегая пузырей.
5. Использование даже движения, медленно потяните ленту от образца, физически извлечения поверхностно-связанной микробов. Закрепите клеточной взимается ленты, липкой стороной вверх, на предметное стекло микроскопа с использованием общих прозрачная лента офиса. Обеспечить надлежащее напряжение / растяжение ленты так, чтобы плоская, без морщинистой поверхностью создается. Это поможет свести к минимуму проблемы с деформацией / свертывания ленты во время последующего нагрева при гибридизации.

2. Твердофазные обогащению и жидких Miniculture поверхности

1. Твердофазные обогащения осуществляется путем размещения ленты лицевой стороной вниз на ксилозы-лизин-Tergitol 4 (XLT-4) агаром, чтобы пробы клетки находятся в непосредственном контакте с поверхности агара. Шаблонный / образец контакт часть ленты находится вровень с поверхностью агара и один конец ленты свободно придерживаться боковой стенке чашки Петри для облегчения удаления ленты от поверхности агара следующие обогащения.
2. Плиты перевернутый (чтобы избежать конденсации) и инкубировали при 35 - 37 ° С тем чтобы обеспечить достаточное рост бактерии рода сальмонелла. Длина инкубационного периода, необходимые для обогащения клетки обнаруживаются уровне будет зависеть от начального уровня загрязнения сальмонеллой. Мы наблюдали отличное образование микроколоний с низкой начальной инокулята через 8 ч обогащения.
3. После обогащения желаемого периода, открытых агар пластины. Лента сохранит свою липкость во время инкубации. Аккуратно нажмите лента против агар использовании указательного пальца для обеспечения максимального извлечения микроколоний формируется на ленту-агар интерфейс. Возьмите ленту с краем прикреплен к стене чашку Петри и удалить его с медленным, даже движения. Горы клеточной взимается ленты, липкой стороной вверх, на стекло микроскопа, как описано в разделе 1.5 выше. Перейдите к разделу "Фиксация и обезвоживание" ступеньку ниже.
4. Для жидких miniculture поверхности, начать с крепления ленты используются для отбора проб на предметное стекло, как описано в разделе 1.5 выше. Затем крышку шаблонных / образец контакт часть ленты с нестерильных силиконовые перфузии камеры (Coverwell, Грейс Био-Labs, Inc), образуя герметичную камеру, дно которой состоит из клеточной взимается ленты, вверх. Крепко, но аккуратно нажмите камеру на место, чтобы обеспечить уплотнение водонепроницаемыми.
5. Использование гибких гель загрузкой пипетки, передача ≤ 500 мкл Бульон Соевый Trypticase или другой подходящей среде обогащения с помощью одного из малых портов камеры на входе. Печать оба порта с прозрачной лентой офис для предотвращения испарения и инкубировать слайды на 35 -37 ° C, сколько необходимо для достаточного обогащения. Хотя все операции должны выполняться в соответствии с надлежащей практикой отбора и обработки, стерильность порта уплотнительную ленту или перфузии камер не требуется в течение жидкой miniculture поверхности. Сочетание FISH и проточной цитометрии позволит ясно дискриминации бактерии рода сальмонелла. от нецелевых бактерии, которые могут присутствовать, с наибольший вклад нецелевых флоры ожидаются из самого образца. Перейдите к разделу "Фиксация и обезвоживание" ступеньку ниже.

3. Фиксация и обезвоживание

1. Для прямой отбор проб поверхностных или для твердых обогащение фазы бактерии рода сальмонелла. на XLT-4-агар, выступать на ленту фиксации клеток в течение 30 мин при 25 ° С, покрывая площадь образца контакт с 500 мкл 10% нейтральный буферный формалин.
2. Отменить фиксатором в герметичный контейнер (под капотом химические сведения к минимуму воздействия раздражающих / токсичных паров).
3. Дегидрировать в серии этанола (50%, 80% и 95%; 300 мкл / 3 мин каждой концентрации). Перейдите к разделу "гибридизации" ступеньку ниже.
4. Для фиксации 500 мкл жидкого образца miniculture поверхностис, перфузии камеры распечатал и гибкий гель загрузкой пипетки используется для извлечения enrichate. Быстрое вверх и вниз пипетирования используется, чтобы помочь в обеспечении эффективного удаления каких-либо оставшейся ленты связанного клеток.
5. Далее, все 500 мкл объема miniculture передается микроцентрифужных трубки и остановлен на 2000 мкг (5 мин). Супернатант отбрасывается, осадок перемешивают энергично в течение 30-60 с, затем ресуспендировали в равном объеме 10% нейтральный буферный формалин. Клетки фиксированной в течение 30 мин при 25 ° C.
6. Далее, фиксирующий удаляется и образец ресуспендировали в ячейку буферной памяти, следующим образом. Образец остановлен на 2000 мкг (5 мин, 25 ° С) супернатант отбрасывается, осадок перемешивают энергично в течение 30 - 60 с, ресуспендировали в равном объеме 50% неденатурированный этиловый спирт-50% фосфатов буферный солевой раствор. Фиксированные клетки могут храниться бесконечно (лет) при температуре -20 ° C. Примечание: Каждый раз, когда жидкости изменяется (например, при введении фиксирующие или различные буфера), важно тщательно ресуспендируют (с вортексе) осадок клеток в минимальном часть (~ 10 - 20 мкл) "исходящих" жидкостной системой . Это поможет предотвратить слипание и гарантируют, что даже суспензии отдельных клеток получаются. Перейдите к разделу "гибридизации" ступеньку ниже.

4. Гибридизация

1. Подготовка гибридизации / мойка буфера с помощью коммерческих молекулярной биологии класса решений отмечено в таблице материалов. Заключительные концентрации компонентов буфера 0,7 М NaCl, 0,1 М Трис [рН 8,0], 10 мМ ЭДТА, 0,1% додецилсульфата натрия, доливают до окончательного желаемого объема с молекулярно-класса водой и фильтруется с помощью шприца 0,22 мкм или чашка фильтра. Этот же буфер, без добавления зондов (см. ниже) используется в качестве моющего буфера. Разогреть гибридизации и стиральные буферов до 55 ° C.
2. Добавить флуоресцентно меченных Sal3 (Nordentoft и др., 1997;. 5'-ААТ CAC TTC АКК TAC GTG-3 ') и Salm-63 (Куттер и др., 2006;. 5'-TCG ACT GAC TTC AGC TCC-3' ) олигонуклеотидных зондов (Материалы таблицу) на разогретой буфером гибридизации. Общая концентрация зонда 5 нг мкл ^{-1 используется} (например, 2,5 нг мкл ^-1 каждый зонд; Биша и Брем-Stecher, 2009a).
3. Для прямого-лента и твердых образцов фазы обогащения, наложение шаблонных площадь контакта образец ленты с 300 мкл буфера, содержащего гибридизации зонд коктейль и гибридизации ленты связанного клеток в влажной, герметичной камере инкубации набор до 55 ° C. Если прямой контакт инкубатор, такие как инструмент Слайд Ров (Материалы таблицы) используется, образцы гибридизированных в течение 15 мин и> 20 слайдов могут быть обработаны одновременно. Если роторно-стиль гибридизации духовке, такие как инструмент Бамбино (по материалам таблицы) используется, слайды расположены в 50 мл полипропиленовые трубы для центрифуг гибридизации, одного слайда в трубке. Поскольку перенос тепла не является прямым, эти образцы гибридизированных на более длительный срок (до 30 мин).
4. После гибридизации, слайды удаляются и зонд содержащих гибридизации буфера наложения отбрасывается. Слайды то либо кратко и осторожно промыть разогретой промывочного буфера с помощью пипетки небольшой объем буфера более наклонена слайд (3 полоскания в 300 мкл каждой), или формально промывают (до 30 мин), либо с наложением разогретой буфера мытья или Погружение в 50 мл трубки полипропилена центрифуги содержащие разогретой буфера стирки. По нашему опыту, хотя формального мыть обеспечит более высокие результаты (меньше дымка от несвязанного зонда), простые полоскания достаточно для однозначного обнаружения бактерии рода сальмонелла. Далее, слайды сушат на воздухе, прежде чем перейти к "Обнаружение" ступеньку ниже.
5. Гибридизация жидких проб miniculture поверхности осуществляется за счет остановки образцов (свеже-фиксированные или хранятся в буфере хранения при температуре -20 ° С) в течение 5 мин при 2000 мкг, а затем энергично вортексе из гранул и ресуспендирования в 100 мкл буфера разогретой гибридизации содержащие Зонд коктейль. Образцы гибридизированных при 55 ° С в течение 30 мин на блок тепла или другой подходящей станции инкубации (материалы см. таблицу), с последующим добавлением 500 мкл буфера разогретой стирки. Как и в ленте связанного образцов, эти образцы могут быть формально мыть в течение до 30 мин с последующей инкубации при температуре 55 ° C в этом промывочный буфер, с прерывистым вортексе. Кроме того, образцы могут быть тщательно перемешивают после добавления 500 мкл буфера разогретой стирки, с последующим немедленным уборки для анализа (см. ниже).
6. В ходе подготовки к выявлению бактерии рода сальмонелла. с помощью проточной цитометрии, жидких проб miniculture поверхности остановлен на 2000 мкг в течение 5 мин, надосадочную жидкость отбрасывается и образцы ресуспендируют в 300 мкл комнатной температуре (~ 25 ° C) PBS. Если образцы требуют транспорта в далеком объекта, или если задержка, как ожидается, между гибридизации и анализа, образцы могут хранить в холодильнике или находящиеся на льду до анализиса. Кроме того, образцы могут быть переданы в ячейку хранения буфера (50:50 смеси PBS и абсолютного этилового спирта) и выдерживают при температуре -20 ° С до недели без заметных потерь в зонд-возложенных флуоресценции (Биша и Брем-Stecher, 2009b) .

5. Обнаружение

1. Для на-ленту обнаружения бактерии рода сальмонелла. с помощью флуоресцентной микроскопии, прямо к ленте или твердых образцов фазы обогащения наложенных с ~ 10 мкл Vectashield H-1200 монтаж среде, содержащей ядерные контрастирующая 4 ',6-diamidino-2-фенилиндола (DAPI), установленного с покровным стеклом, затем инкубировали в темноте в течение 10 мин.
2. Погружение нефти находится на покровное стекло, и образцы изучены с помощью высоким увеличением нефти цели (63x или 100x). DAPI фильтр используется для внесения образца в фокусе, микроскоп, затем переключился на соответствующий фильтр (зеленого или красного цвета, в зависимости от красителя используется для конечного этикетке зондов) и сальмонеллы клетки оцениваются визуально по их флуоресценции (рис. 2 и 3).
3. Для цитометрии обнаружения жидких проб miniculture поверхности, различные инструменты могут быть использованы, в зависимости от наличия в конкретном регионе. В нашей лаборатории, PBS-приостановлены образцы передаются в 5 мл круглым дном выборки труб (BD Falcon) и изучены с помощью цитометра FACSCanto потока с возбуждения при 647 нм (Материалы таблицу). Для обогащенных образцов, содержащих большое число от общего числа бактерий, "низкий расход" настройки (10 мкл мин ^-1) используется и 5,000-50,000 событий собираются. Данные анализируются с помощью программного обеспечения FlowJo (версия 8.8.6, Дерево Star, Inc, Ashland, OR) или другое подходящее программное обеспечение для анализа (рис. 4, панелей и В).

6. Представитель Результаты

Рисунок 1. Использование клейкой ленты для отбора проб бактерии рода сальмонелла. с поверхности искусственно загрязненных помидор.

Рисунок 2. Типичные результаты для прямой-лента отбора проб и FISH обнаружения сальмонеллы Typhimurium АТСС 14028 от поверхности томатный (100 X нефти цель). Двухзондовой коктейль из Texas Red-меченых зондов (Sal3/Salm-63) был использован для обозначения этих клеток.

Рисунок 3. Микроколонии сальмонеллы Typhimurium АТСС 14028 формируются на поверхности Ксилоза Лизин Tergitol-4 (XLT-4) агара после 8 часов на ленту обогащения при температуре 37 ° C. начального инокулята был пробы с поверхности искусственно загрязненных помидор. Твердофазные обогащение увеличивает количество клеток для обнаружения, а также повышает клеточный содержание рРНК.

Рисунок 4. Использование клейкой ленты для отбора проб С. enterica серовар Typhimurium от поверхности искусственно загрязненных помидор, а затем с помощью прямого анализа FISH и проточной цитометрии (панель) или после 5 часов неселективным жидким обогащения miniculture поверхности в перфузионной камере, наполненной 500 мкл Trypticase соевом бульоне (группа В ).

Обсуждение

Простые и быстрые методы для обнаружения патогенов на производство поверхности могут помочь смягчить болезней пищевого происхождения путем предоставления своевременной и актуальной информации. Скотч основе методов выборки были использованы в экологические, клинические и микробиологии пищевых продуктов с 1950-х годов и включают нажатием "скотч" стиле ленту к поверхности для удаления микроорганизмов с последующей прямой микроскопии или передача приверженцем микроорганизмов твердых сред для роста (Барнетсон и Мил...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Лента для отбора проб Fungi-Tape	Device Laboratory	745	http://www.scientificdevice.com/
Con-Tact-It Лента для отбора проб	Birko Corporation, Денвер, Колорадо		http://www.birkocorp.com/
Прозрачная офисная лента, общая	Различные		Должны быть оптически прозрачными, иметь низкую внутреннюю флуоресценцию
Пищевая поверхность	Местный продуктовый магазин		Томат– s (красный томат–
		211768Для	неселективного обогащения жидкой поверхности миникультуры
Ксилоза-лизин-Тергитол 4 агаровая основа	Difco Laboratories	223420	Для <эм>Сальмонелла-селективный агар (XLT-4)
Ксилоза-лизин-Тергитол 4 добавка агара	Дифко Лаборатории	235310	Для<им> Сальмонелла-селективный агар (XLT-4)
Раствор формалина	Sigma-Aldrich	HT5011	10% раствор, нейтральный, буферный (клеточный фиксатор)
Абсолютный этанол	Sigma-Aldrich	E7023	Класс молекулярной биологии (предгибридизационная дегидратация)
1,5 мл микроцентрифужные пробирки	Различные		РНКазы- и ДНКазные
предметные стекла и покровные стекла для микроскопа	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Раствор NaCl	Sigma-Aldrich	S5150	класса молекулярной биологии, 5М раствор (гибридизационный буферный компонент)
Трис-ЭДТА буферный раствор (100Х концентрат)	Sigma-Aldrich	T9285	1М Трис [pH 8.0], 0.1М ЭДТА (гибридизационный буферный компонент)
Раствор додецилсульфата натрия	Sigma-Aldrich	L4522	10% раствор в воде 18 МОм (гибридизационный буфер
Олигонуклеотидные зонды Sal3 и Salm-63	Интегрированные DNA Technologies		5'-меченые 6-карбоксифлуоресцеином (FAM) или Texas Red (для микроскопии) или Cy5 (для цитометрии), очищенные от ВЭЖХ
Микроцентрифуга с регулируемой скоростью	Различные		Используйте диаметр ротора для расчета необходимых оборотов для значений RCF, описанных в протоколе
Перфузионная камера	CoverWell Grace Bio-Lab Inc.	PC1R-2.0	Нестерильные
гелевые наконечники для пипеток (FS MultiFlex)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	05-408-151	Длинные, тонкие наконечники для легкого доступа к небольшим отверстиям для отбора проб и маневренности в камере
Алюминиевый нагревательный блок или прецизионно управляемая нагревательная станция	Различные		термомиксеры Eppendorf R Здесь используется шейкер для нагрева и охлаждения сухих блоков
Bambino мини-гибридизация	Boekel Scientific	модель 230300	Слайды помещены в полипропиленовые центрифужные пробирки объемом 50 мл для гибридизации, теплопередача не
Гибридизатор предметного стекла	Boekel Scientific	Model 240000	Обеспечивает быструю, прямую передачу тепла через стеклянное стекло
Vectashield H-1200 монтажная среда с 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI)	Vector Laboratories	H-1200	Минимизирует гашение флуоресценции во время микроскопии, обеспечивает противодействие DAPI
Флуоресцентный микроскоп	Различные		Leitz Laborlux S использован здесь
Цифровой фотоаппарат	Различные		фотоаппараты Canon PowerShot A640 используются здесь
Программное обеспечение для получения изображений	Различное		программное обеспечение Axiovision v. 4.6 (Carl Zeiss) используется
Adobe Photoshop	Adobe		Для минимальной обработки изображений (наложение изображений, сделанных в разных каналах)
Проточный цитометр	Различный		Используется кантопроточный цитометр FACSКонто (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния) с красным (647 нм) возбуждением Используемое
программное обеспечение для анализа проточной цитометрии	Различные		программы FlowJo v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.)