В режиме реального времени Визуализация лейкотриена B 4 Опосредованного миграции клеток и BLT1 Взаимодействие с β-arrestin

Краткое содержание

Эта статья описывает методологию для определения хемотаксиса лейкоцитов ответ на специфических лигандов и определить взаимодействие между рецепторами клеточной поверхности и цитозольного белков с использованием живых методов визуализации клеток.

Аннотация

Рецепторы, сопряженные с G-белками (GPCR), относятся к семейству белков с семью трансмембранными доменами и опосредуют передачу внеклеточных сигналов для формирования внутриклеточных ответов. GPCR регулируют различные биологические функции, такие как хемотаксис, высвобождение внутриклеточного кальция и регуляция экспрессии генов, причем этот процесс зависит от лиганда и осуществляется через гетеротримерные G-белки^1-2. Связывание лиганда вызывает серию конформационных изменений, приводящих к активации гетеротримерных G-белков, которые модулируют уровни вторичных посредников, таких как циклический аденозинмонофосфат (cAMP), инозитолтрифосфат (IP3) и диацилглицерин (DG). Одновременно с активацией рецептора связывание лиганда также инициирует ряд событий, направленных на ослабление передачи сигнала рецептором посредством десенсибилизации, секвестрации и/или интернализации. Процесс десенсибилизации GPCR происходит за счет фосфорилирования рецептора киназами рецепторов, сопряженных с G-белками (GRK), и последующего связывания β-аррестинов³. β-аррестины представляют собой цитозольные белки, которые при активации GPCR транслоцируются к мембране, где связываются с фосфорилированными рецепторами (в большинстве случаев), тем самым способствуя интернализации рецептора ^4-6.

Лейкотриен B₄ (LTB₄) представляет собой провоспалительную липидную молекулу, синтезируемую в результате метаболизма арахидоновой кислоты; он опосредует свои действия через GPCR — рецептор 1 LTB₄ (BLT1; высокоаффинный рецептор) и рецептор 2 LTB₄ (BLT2; низкоаффинный рецептор)^7-9. Было показано, что путь LTB₄-BLT1 играет критическую роль при ряде воспалительных заболеваний, включая астму, артрит и атеросклероз^10-17. В данной работе описываются методики, разработанные для мониторинга индуцированной LTB₄ миграции лейкоцитов, а также взаимодействия BLT1 с β-аррестином и транслокации рецептора в живых клетках с использованием методов микроскопической визуализации^18-19.

Дендритные клетки костного мозга мышей линии C57BL/6 были выделены и культивированы, как описано ранее ^20-21. Эти клетки были протестированы с помощью методов прижизненной визуализации для демонстрации миграции клеток, индуцированной LTB₄. Человеческий белок BLT1 был помечен красным флуоресцентным белком (BLT1-RFP) на C-конце, а β-аррестин1 — зеленым флуоресцентным белком (β-arr-GFP); обе плазмиды были трансфицированы в клеточную линию базофильной лейкемии крыс (RBL-2H3)^18-19. Кинетика взаимодействия между этими белками и их локализация отслеживались с помощью видеомикроскопии живых клеток. Методики, описанные в данной работе, касаются использования методов микроскопии для исследования функциональных ответов рецепторов, сопряженных с G-белком, в живых клетках. В данной работе также описывается использование программного обеспечения Metamorph для количественного определения интенсивности флуоресценции с целью установления кинетики взаимодействия рецептора и цитозольных белков.

Протокол

Методология

Описание микроскоп

Живая клетка экспериментов изображений производится с помощью FM-TE-эпи-флуоресценции систему, подключенную к инвертированный микроскоп Nikon Eclipse, TE300. Микроскоп оснащен отопления стадии. Прохладный оснастки HQ цифрового Ч / Б CCD (Roper Scientific) камеры и LAMDA 10-2 оптический фильтр чейнджер (Саттер инструмент компании) крепится к микроскопа. Возбуждение и излучение длиной волны контролируются с фильтром колеса и контролируется Ламба 10-2 фильтр контроллер колесо, Саттер инструменты Co Выдержка 500 мс должно быть достаточно, чтобы посмотреть в ППП или GFP в живых клетках. Ап....

Обсуждение

Живая клетка изображений является мощным инструментом для демонстрации функции и взаимодействие специфических белков, как они происходят в режиме реального времени. Методы, описанные в этой рукописи ясно показывают, что LTB ₄ может вызвать быструю миграцию дендритных клеток. Эти методы не только расширить аспекты LTB ₄ функции разнообразных типов клеток, они позволяют подобные методы, применяемые к ряду других хемокинов и тестирования их эффективности в качестве агентов на хемотаксиса лейкоцитов ра.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Линия клеток базофильной лейкемии крысы (RBL-2H3) или клетки HEK293.	ATCC	CRL-2256
Дельбекко’модифицированная среда Игла (Eagle)’среда DMEM (дуло-МcCой)	Invitrogen	11995
Среда RPMI или DMEM без фенолового красного	Invitrogen	11835-030
Фетальная бычья сыворотка	Invitrogen	16000-044
L-глутамин (200 мМ)	Invitrogen	25030
Пенициллин-стрептомицин (10000 ЕД/мл)	Invitrogen	15140
Трипсин, 0,05% (1X) с ЭДТА 4Na, жидкий	Invitrogen	25300
HEPES (1 М)	Invitrogen	15630
стерильные стеклянные чашки Fluoro с покровным стеклом (толщиной 0,17 мм) диаметром 35 мм (WillCo-dish)	World Precision Instruments, Inc.	FD35-100
Стерильная кювета для Gene Pulser (зазор между электродами 0,4 см) (Bio-Rad)	Bio-Rad	16552088
электропоратор Gene Pulser II	Bio-Rad
Система эпифлуоресценции TE-FM, установленная на инвертированном микроскопе Nikon Eclipse TE300	Приборы Nikon
Программное обеспечение Metamorph	Универсальная визуализация
Вертикальный вытягиватель микропипеток	Narishige International
Micro-Forge M-900	Narishige International
Гидравлический микроманипулятор MO-188NE	Narishige International
Грубый ручной манипулятор, MN-188NE	Narishige International
<сильный>конструкции кДНК:
кДНК G-белоксопряженного рецептора с меткой в виде красного флуоресцентного белка на C-конце (hBLT1-RFP)	Джала и соавт. 2005
кДНК цитозольного белка с GFP-меткой (β-arrestin1-GFP в настоящем исследовании).	Джала и др., 2005