Методическая статья

Моделирование биологических мембранах с плат и измерения электрических сигналов в Аксоны: Упражнения студенческой лаборатории

24.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/2325

⸱

18 января 2011 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Kentucky, 2Department of Physiology, University of Toronto

В этой статье

Краткое содержание

Это демонстрация того, как биологические мембраны могут быть поняты с помощью электрических моделей. Мы также продемонстрировать процедуры регистрации потенциалов действия от брюшной нервной цепочки из раков для студентов ориентированы лабораторий.

Аннотация

Это демонстрация того, как электрические модели могут быть использованы для характеристики биологических мембран. Это упражнение также вводит биофизических терминологии, используемой в электрофизиологии. Такое же оборудование, используемые в мембранных моделей, как на живых препаратах. Некоторые свойства изолированного шнура нерва исследуются: нервные потенциалы действия, набор нейронов, и отзывчивость нерв шнур к факторам окружающей среды.

Протокол

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1) Теоретические основы

Фундаментальные знания об электрических цепях являются ценным инструментом для понимания и концептуализации многих аспектов физиологического экспериментирования и теории. Данное упражнение предназначено для ознакомления с некоторыми общими принципами, касающимися источников напряжения, электрического сопротивления и электрической емкости. Эти вводные понятия создают базу для понимания таких явлений, как синаптическая передача и распространение электрических сигналов по нервному волокну.

Предостережение: в стандартных повседневных электрических цепях, состоящих из металлических проводов и резисторов, ТОК переносится электронами, которые имеют отрицательный заряд. В биологических системах ток переносится ИОНАМИ, которые могут иметь один или несколько положительных или отрицательных зарядов. По определению, ток течет от положительного полюса к отрицательному (хотя, разумеется, электроны фактически движутся в противоположном направлении).

Компоненты схемы представляют электрические свойства живой ткани и, в некоторых случаях, неодушевленных объектов (таких как электроды), используемых в ее исследовании.

В процессе выполнения упражнения записывайте результаты и расчеты.

1.2) Общие принципы

Основные свойства электрических цепей с постоянным током описываются законом Ома
V = IR
Где V = напряжение в вольтах (V)
I = сила тока в амперах (A)
R = сопротивление в омах (Ω)

Этот закон определяет потенциалы, которые наблюдаются в нервных клетках при использовании электродов. Сначала мы продемонстрируем закон Ома и его применение к биологическим материалам.

1.3) Материалы

ОбъектКоличество
Макетная плата1
Резисторы: 330 кОм1
100 кОм12
33 кОм6
22 кОм1
10 кОм6
4,7 кОм1
2,2 кОм1
1,5 кОм1
1 кОм1
510 Ом1
330 Ом1
220 Ом1
150 Ом1
100 Ом1
Конденсаторы: 0.1 μF6
: 10 μF6
Провода12
PowerLab1
Выходные провода PowerLab1
Вводные провода PowerLab1
Вольтметр (с возможностью измерения силы тока)1

Таблица цветовой маркировки резисторов

ЦветЦифра
Черный0
Коричневый1
Красный2
Оранжевый3
Желтый4
Зеленый5
Синий6
Фиолетовый7
Серый8
Белый9
СеребряныйДопуск 10%
ЗолотойДопуск 5%

1Пожалуйста, предоставьте текст для перевода. Полоса - 1Пожалуйста, предоставьте текст для перевода. Цифра
2нд Полоса — 2не определено Цифра
3НИР (Научно-исследовательская работа) Полоса — количество нулей
4th Диапазон — Допуск

Схема установки электронного эксперимента с компьютером, мультиметром и макетной платой для анализа и тестирования цепей.
Рисунок 1: Схема системы. Компьютер, макетная плата и лабораторный блок питания с выходным стимулятором.

Система PowerLab (интерфейс PowerLab от AD Instruments, Австралия) будет использоваться в данном эксперименте в качестве источника напряжения. Подключите USB-кабель PowerLab к компьютеру, включите PowerLab и запустите программу LabChart с рабочего стола. Выберите «New File». Появится окно с несколькими каналами записи. Выберите «Setup» в верхней части экрана и нажмите «Channel Settings». В левом нижнем углу окна уменьшите количество каналов (Number of Channels) до 1; для канала 1 (Channel 1) установите диапазон (Range) 5 V. Подключите кабель стимулятора с двумя мини-зажимами к выходным портам (Output) на PowerLab: подключите красный соединительный кабель к положительному выходному порту, а черный — к отрицательному выходному порту. Далее необходимо изменить выходную мощность, частоту и длительность импульса PowerLab. Для этого выберите «Setup», а затем «Stimulator Panel». Для первой части эксперимента требуются длинные импульсы напряжением 1.5 V, поэтому установите амплитуду на 0.75 V; это обеспечит размах 1.5 V (PowerLab будет выдавать напряжение, колеблющееся между +0.75 V и -0.75 V). Установите частоту (0.5 Hz) и длительность импульса (1 s).

Схема электрофореза; процесс разделения ДНК; дорожки геля демонстрируют различия в молекулярной массе
Рисунок 2: Схемы макетной платы. Цветные полосы по бокам соединены в один общий узел для каждого соответствующего цвета. Два горизонтальных столбца в центре соединены в каждой своей половине для данной строки, но не пересекают центральную линию и не соединены с боковыми полосами. Каждая строка в центре независима от следующей строки.

При использовании макетной платы с обеих сторон расположены две колонки, предназначенные для входных и выходных выводов. Положительный полюс обычно подключается к правой положительной колонке, в которой все отверстия соединены между собой. Отрицательный вход подключается к противоположной стороне макетной платы, где также все отверстия в колонке соединены. В центре, между двумя группами колонок, находится несколько рядов по пять ячеек, каждая из которых независима от остальных. Все пять ячеек в одном ряду соединены друг с другом, но изолированы от других рядов. См. Рисунок 2. Выделенные области показывают, какие части макетной платы взаимосвязаны. Полезное видео по использованию макетных плат можно найти в сети по адресу http://www.youtube.com/watch?v=oiqNaSPTI7w&feature=related

Упражнение 1

Используйте закон Ома, чтобы рассчитать СИЛУ ТОКА в следующей цепи:
Схема электрической цепи, статическое равновесие, батарея 1,5V, резистор 1500Ω, анализ тока.
Сила тока (Цепь 1): ________________A

Упражнение 2
Измерьте напряжение на резисторе, сопротивление резистора и силу тока, протекающего через указанную схему (Сеть 1).

Цифровой мультиметр, отображающий значение емкости; необходим для электрических измерений и диагностики.
Рисунок 3: Вольтметр Wavetek Meterman.

Воссоздайте Цепь 1 на макетной плате, используя резистор 1500 Ω; в качестве источника напряжения (1.5 V) используйте систему PowerLab. Измерения напряжения, тока и сопротивления проводятся с помощью вольтметра. Для получения точных данных с вольтметра оба щупа (красный и черный) должны касаться оголенных участков проводов в цепи. Также переключатель должен быть установлен на постоянное напряжение (DC) в диапазоне, соответствующем масштабу конкретной экспериментальной установки. Для измерения напряжения приложите оба щупа вольтметра к двум концам резистора. При измерении сопротивления резистора (а не падения напряжения) ОТКЛЮЧИТЕ источник напряжения и снова приложите оба щупа к резистору. Для измерения тока вольтметр должен быть включен ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНО в цепь; обратите внимание, что красный и черный щупы должны быть ориентированы правильно относительно направления тока.

Напряжение (Цепь 1): ________________V
Сопротивление (Цепь 1): ________________Ω
Ток (Цепь 1): ________________A

Теперь с помощью Power Lab измерьте напряжение на Цепи 2 (аналогично Цепи 1, но на макетной плате), так же, как вы делали это с помощью вольтметра. Отсоедините вольтметр и подключите выводы измерительного пробника для напряжения с красным и черным зажимами. Далее с помощью курсора нажмите на «Channel 1» (в правой части экрана). Нажмите и перейдите в раздел «input amplifier». Затем в появившемся окне нажмите кнопку «differential» и установите диапазон на 5 V. Нажмите «OK», чтобы сохранить изменения.

Нажмите «Start» (в правом нижнем углу) для сбора данных. Процесс можно остановить в любой момент для измерения отклонения напряжения. Чтобы измерить собранное напряжение, нажмите «Stop», выберите курсор «M» (в левом нижнем углу) и переместите его на базовую линию, перетащив его. Затем переместите свободный курсор к верхней точке кривой напряжения для измерения амплитуды. Снимите показания изменения напряжения (ΔV) и запишите данные на бумаге. Результаты можно подтвердить с помощью автономного вольтметра.

1.4) Сопротивление и проводимость при последовательном соединении

Принцип делителя напряжения: падение напряжения на сумме всех последовательно соединенных резисторов равно напряжению источника. Напряжение на каждом отдельном резисторе зависит от доли общего сопротивления, которую представляет этот резистор. Таким образом:
Уравнение делителя напряжения; V1=V(source)R1/(R1+R2); формула анализа цепей; проектирование электроники.
Пара резисторов разделяет напряжение в соотношении их индивидуальных сопротивлений.

Упражнение 3

Рассчитайте падение напряжения на каждом резисторе в Схеме 3. Проверьте свои расчеты, измерив фактическое напряжение с помощью вольтметра и программного обеспечения Power Lab при подключенном источнике питания 1,5 V.
Схема электрической цепи, источник 1,5V, резисторы R1 510Ω, R2 1500Ω, анализ статического равновесия.
СХЕМА 3. Используйте два указанных выше резистора.

Вычисленное значение:Измерено:
Напряжение (на R)1):_______VНапряжение (на R)1): ________________V
Напряжение (на R)2):_______VНапряжение (на R)2): ________________V

1.5) Пример биологического применения:

Различия в электрических свойствах внутренней среды клетки и внешнего раствора активной нервной клетки представляют собой пример делителя напряжения. Эту биологическую цепь можно изучить с помощью записей, полученных с помощью внешних электродов. Активная область нервной клетки, в которой происходит проникновение ионов, действует как источник напряжения; ток течет из этой области вдоль внутренней части клетки и возвращается через внешний раствор. Таким образом, между двумя точками мембраны, имеющими разный потенциал, возникает ток, который обязательно должен быть одинаковым как внутри волокна, так и снаружи; поскольку сопротивление внутренней среды выше, чем внешней, наибольшее падение напряжения происходит именно здесь.

Рассмотрим систему и ее эквивалентную схему (Рисунок 4: A и B):
Схема измерения тока нервной клетки, показывающая подключения осциллографа и пути сопротивлений Ro и Ri.
Эквивалентная схема:
Схема цепи с источником 120 mV, резисторами Ro, Ri, осциллографом; измерение напряжения и тока.
Рисунок 4: A (вверху). Поток электрического тока через биологическую клеточную мембрану. B (внизу). Эквивалентная электрическая схема. Источник напряжения (120 mV) представляет собой трансмембранное напряжение, создаваемое потенциалом действия нервной клетки.
Примечание: R0 и Ri фактически соединены последовательно (а не параллельно) из-за расположения источника питания. Эквиваленное изображение схемы выглядит следующим образом:
Схема электронной цепи; делитель напряжения, резисторы \(R_0 = 10^4 \Omega\), \(R_t = 10^6 \Omega\).
Рисунок 5: Альтернативная эквивалентная электрическая схема для Рисунка 4A.

Упражнение 4.
Дано:
Vm, мембранный потенциал = 120 mV
Ri, сопротивление внутренней жидкости = 106 Ω
R0, сопротивление внешней жидкости = 104 Ω
Вычислите V0, потенциал между электродами A и B.
V0: ________________V

Упражнение 5.

Используя схему 4 (см. ниже), измерьте разность потенциалов на каждом резисторе (R0 и Ri).
СХЕМА 4. Соедините резисторы 4.7 K Ω и 10 K Ω последовательно с источником питания 1.5 V:
Схема электрической цепи с батареей 1.5V и резисторами 4.7KΩ, 10KΩ, иллюстрирующая электрическую сеть.
Измерьте напряжение с помощью вольтметра.
Напряжение (на R0): ________________V
Напряжение (на Ri): ________________V

СЕТЬ 5 : Аналогична Сети 4, за исключением того, что R0 = 1 K Ω
Обратите внимание, что в Сети 5 внешнее сопротивление намного ниже (что аналогично наличию большого количества жидкости или неактивной ткани, шунтирующей электроды), отсюда важность регистрации сигналов с нервов на воздухе или под изолирующим маслом для увеличения внешнего сопротивления.
Напряжение (на R0): ________________В
Напряжение (на Ri): ________________В

1.6) Сопротивление и проводимость при последовательном и параллельном соединении

Пример биологического применения:

Хорошим примером последовательного и параллельного соединения резисторов является электрическая конфигурация химического синапса. Электрическая передача сигнала через большинство синапсов невозможна из-за шунтирующего эффекта синаптической щели. Однако стоит отметить, что этот шунт, вероятно, необходим для возникновения значительного потенциала на пресинаптической мембране, что способствует высвобождению нейромедиатора.

Схема синаптической передачи; постсинаптическая мембрана, путь возбуждения клетки, электрическое сопротивление.
Рисунок 6: Модель электрохимического потока через синапс.
Схема электрической цепи с резисторами (Rm1, Rm2, Rm3, Rs) для сетевого анализа.

Следует отметить, что в живой ткани значительные электрические сопротивления возникают на мембранах и в ограниченных внеклеточных пространствах. Относительно большие объемы жидкости, такие как цитоплазма клеток или промывные растворы, не представляют собой значительных сопротивлений.

Упражнение 6.
Сеть 6 (см. выше и схему платы) представляет собой аналог химического передающего синапса. В электрических синапсах синаптическая щель (шунтирующее сопротивление Rs) отсутствует, и ток течет непосредственно от пресинаптической клетки к постсинаптической через Rm1 и Rm2, а затем через Rm3. Затухание в сети можно легко измерить при различных значениях резисторов, что позволяет проиллюстрировать изменения в разных типах синапсов. Подключите ваш PowerLab к источнику 1.5V (т. е. установите значение 0.75 Volt).

  1. С помощью мультиметра измерьте разность потенциалов (РП) на каждом резисторе в данной цепи. Запишите значения резисторов. Отдельно зафиксируйте РП на Rm3 (мембране постсинаптической клетки). Напряжение: ________________В
  2. Замените резистор 330 Ω в позиции Rs на резистор 330K Ω. Измерьте РП на Rm3.
  3. Теперь, оставив Rs равным 330K Ω, замените резистор 330K Ω в позиции Rm2 на резистор 33K Ω. Измерьте РП на Rm3. Напряжение: ________________В
  4. Теперь, оставив Rs равным 330K Ω и Rm2 равным 33K Ω, замените резистор 22K Ω в позиции R m1 на резистор 220 Ω. Измерьте РП на Rm3. Напряжение: ________________В

Упражнение 7
Пример последовательно-параллельной резистивной сети встречается при рассмотрении кабельных свойств нервного или мышечного волокна. ПОСТОЯННАЯ ДЛИНЫ волокна — это расстояние, на котором разность потенциалов (РП) на мембране снижается до 37% от своего первоначального значения. Затухание происходит из-за того, что внутреннее и внешнее сопротивления жидкости по обе стороны мембраны шунтируются (относительно высоким) поперечным сопротивлением мембраны. Значение сопротивления ограничивает передачу сигнала вдоль аксона нервной клетки. Постоянная длины составляет 1/e, как измеряется для экспоненциального затухания. dE/dT=-E/RC; где E — разность напряжений, R — сопротивление, а C — емкость. Или в другой форме E=Eoexp (-t/RC); где Eo — начальное напряжение, а t — время в секундах. RC также называют тау (τ), постоянной времени.

При допущении, что сопротивление внешней жидкости пренебрежимо мало по сравнению с внутриклеточным сопротивлением и сопротивлением мембраны, пассивные резистивные свойства мембраны могут быть представлены следующей схемой:
Диаграмма сети резисторов для расчета постоянной длины; показаны значения Rm и Ri в электрической цепи.
Диаграмма сети резисторов; схема установки вольтметров для расчета постоянной длины при анализе электрической цепи.
Схема на макетной плате с резисторами и проводами, иллюстрирующая базовую установку электрической цепи.
Рисунок 7: Перенос схемы 7 на макетную плату.

Подайте напряжение на один конец Сети 7 между точками A и B. Используйте стимулятор, выбрав импульс длительностью 1s, амплитудой 1V (установите 0.5 V) и частотой 0.75Hz. Последовательно подключите вольтметр к каждому резистору «мембраны» и зафиксируйте разность потенциалов (РП) на этом резисторе. Оставьте один конец щупа вольтметра неподвижным в точке (вывод A, красный), а другой щуп перемещайте последовательно по позициям 1–5. Постройте график зависимости РП от «расстояния» от источника, приняв расстояние между резисторами мембран за единичное. По полученному графику определите постоянную длины данной цепи. График разности потенциалов в зависимости от расстояния; анализ электрического поля, физическая концепция, PD(V).
График постоянной длины Сети 7:______________

Эффектом увеличения поперечного сопротивления мембраны, которое возникает при наличии миелиновой оболочки, или уменьшения продольного внутреннего сопротивления волокна, связанного с увеличением его диаметра, является изменение постоянной длины. Значения резисторов не соответствуют тем, что фактически обнаруживаются в аксоне нерва, но являются приблизительно пропорциональными. Аналогично, «единица расстояния» в модели существенно масштабирована по сравнению с реальной нервной клеткой.

1.7) Емкость

Конденсаторы накапливают заряд. Если к конденсатору через резистор приложить напряжение, в конденсаторе возникнет ток, и тогда разность потенциалов (РП) на конденсаторе будет расти экспоненциально со временем, приближаясь к РП источника; временной ход этого изменения напряжения зависит от приложенного напряжения, емкости и последовательного сопротивления. Аналогичный, но инвертированный временной ход наблюдается при разряде конденсатора.
Схема RC-цепи с резистором 100K Ом и конденсатором 10μF.
Подключите вход этой простой резисторно-конденсаторной (RC) цепи к стимулятору в точках A и B. Используйте импульсы напряжением 1V (установите 0,5V) длительностью 1s и частотой 0,75Hz. Также необходимо установить частоту сбора данных на 20 K /sec (с правой стороны панели). Подключите входные зажимы PowerLab параллельно конденсатору. Выполните запись в течение нескольких секунд, затем остановите её. Используйте окно Zoom, чтобы увеличить время нарастания одного из прямоугольных импульсов. Возможно, потребуется повторить масштабирование несколько раз, чтобы растянуть кривую. Измерьте время нарастания от базовой линии до верхней точки кривой напряжения в момент ее выравнивания. Проследите за временным ходом изменения потенциала и искажением прямоугольных импульсов. Изучите эффект замены конденсатора 10μF на конденсатор 0,1 μF. Подключив вольтметр PowerLab параллельно резистору, вы сможете наблюдать временной ход протекания тока через цепь. Запишите всего несколько импульсов, затем остановите запись для проведения измерений. Используйте курсор «M» для перемещения к базовой линии перед нарастанием, а свободный курсор — к точке, где напряжение начинает выравниваться.

Последний пример включает в себя как резистивные, так и емкостные компоненты. Пассивные кабельные свойства нервных и мышечных волокон определяются аналогичными элементами, обусловленными свойствами клеточной мембраны. В клетке присутствует не только поперечное мембранное сопротивление, но и мембранная емкость, что связано с электрическими свойствами клеточной мембраны. Это, в свою очередь, влияет на временную динамику развития электротонически распространяющихся потенциалов.

Пример:
Схема электрической цепи для расчета постоянной длины; резисторы, конденсаторы, анализ сети.
Данную сеть можно собрать на основе Сети 7, подключив необходимые конденсаторы параллельно мембранным резисторам (Rm).

Упражнение 8.
Подключите конденсаторы 10 μF к Сети 7. Используя импульсы стимулятора длительностью 1s, напряжением 1V (настройка 0.5 V) и частотой 0.75Hz, который должен быть подключен в точках A и B, пронаблюдайте за изменением потенциала на каждом мембранном резисторе. Принимая «пороговое» напряжение (напряжение, при котором в нервной клетке генерируется потенциал действия) равным 0.2V, измерьте время, необходимое для достижения порогового значения потенциала на каждом мембранном резисторе. Под порогом здесь понимается значение потенциала, при котором в живой клетке может возникнуть потенциал действия. Постройте график зависимости времени от «расстояния».

Электронная схема на макетной плате для эксперимента по RLC-резонансу, включающая резисторы и конденсаторы.
Рисунок 8: Перенос схемы Сети 9 на макетную плату.

График зависимости времени от расстояния; оси: расстояние (единица длины), время достижения 0,2 V.
График к рисунку 8.

Смоделируйте эффект снижения емкости мембраны, вызванного увеличением толщины миелиновой оболочки, заменив конденсаторы на более подходящие емкостью 0.1μF. Отметьте изменение времени достижения порога при выбранном сопротивлении резистора. Наложите полученные данные на тот же график, который был построен для конденсаторов с большей емкостью.

Что касается мышечной мембраны, можно представить увеличение емкости за счет расширения площади поверхности мембраны благодаря связанным с ней T-трубочкам, что приводит к более высокой емкости мембраны по сравнению с нейроном. Конденсаторы меньшей емкости могут быть использованы для иллюстрации снижения емкости при добавлении миелина к немиелинизированному аксону нерва. Основной тезис здесь заключается в том, что электрическая емкость пропорциональна площади поверхности и обратно пропорциональна толщине диэлектрического слоя (миелина), который разделяет «пластины» или накопительные поверхности конденсатора.

Свойства, представленные на модельной схеме, наблюдаются в живых препаратах. Однако клетки различаются по таким характеристикам, как утечка через мембрану и осевое сопротивление. Некоторые клетки не генерируют потенциалы действия. Тем не менее, потенциал действия возникает, когда сигнал должен быть передан на расстояние в несколько миллиметров, поскольку пассивные электрические свойства клеток затухают на таком расстоянии. В следующей серии экспериментов демонстрируется регистрация потенциалов действия.

1.8) Вопросы для студентов

  1. Каковы типичные значения постоянной длины для нейронов и мышечных клеток?
  2. Что произойдет, если мембрана будет иметь низкое мембранное сопротивление: изменится ли постоянная времени (время достижения 63% от конечного значения)? Если да, то как она изменится при более низком мембранном сопротивлении? Какова общая математическая формула для постоянной времени (tau)?
  3. Почему более крупные аксоны, такие как гигантский аксон кальмара, могут проводить электрические сигналы быстрее, чем более мелкие аксоны в том же препарате кальмара?

2. ПРОВОДНИЦКИЕ СВОЙСТВА НЕРВНЫХ КЛЕТОК

2.1) От макетной платы к живым клеткам

Пассивные свойства, продемонстрированные в упражнениях с печатными платами, также измеряемы в живых клетках; однако эти пассивные свойства может быть сложно выделить, когда они сопровождаются потенциалами действия в нервных клетках. Активные свойства нейрона заключаются в его способности поддерживать потенциал покоя мембраны, генерировать потенциалы действия и регенерировать их вдоль участка мембраны.

Электрический ток вдоль нервного тяжа может быть регенеративным как внутри отдельных нейронов, так и при передаче от одного нейрона к другому. В брюшном нервном тяже (VNC) речного рака некоторые нейроны взаимодействуют через септальные (т. е. щелевые) контакты. Как было показано в предыдущих упражнениях с макетной платой, изменение сопротивления может препятствовать проведению электрических сигналов. Это аналогично изменению тока через щелевые контакты в брюшном нервном тяже.

В следующей серии экспериментов исследуются скорость проведения и другие свойства сложного потенциала действия в вентральном нервном шнуре (VNC). Мы продемонстрируем, как подготовить VNC для проведения экспериментов, а также как вызывать и измерять ответы, используя стандартное оборудование, предназначенное для студенческих лабораторных работ.

2.2) Подготовка препарата из речного рака

Для данного эксперимента лучше всего подходит брюшная нервная цепочка речного рака. Этот нерв легко препарируется, и с данной подготовкой можно использовать различные протоколы, влияющие на проведение импульса. Перед началом эксперимента ознакомьтесь с приведенными ниже терминами по анатомии рака:
Анатомическая схема ракообразного; обозначены области: головогрудь, брюшко, придатки.
Рисунок 9. Общая схема анатомии речного рака.
Модифицировано из: http://www.enchantedlearning.com

2.3) Основы проведения импульса по нерву

Вентральный нервный шнур речного рака служит для передачи сигналов, инициирующих реакции избегания, такие как реакция отбрасывания хвоста. В данном эксперименте запись будет проводиться со всего интактного нервного шнура. Индивидуальные потенциалы каждого нейрона внутри нервного шнура суммируются, образуя сложный потенциал действия, который проявляется в виде измеряемых электрических импульсов в программе записи. Эрланджер, Гассер и Бишоп (1924) были одними из первопроходцев, описавших сложные потенциалы действия. В работе представлены характеристики рефрактерного периода, скорость проведения, а также нейронные эффекты ингибитора щелевых контактов 1-гептанола или влияния температуры. Изучение основных принципов передачи сигналов нервных клеток способствует более глубокому пониманию неврологических функций в целом (Bennett, et al., 1991; Furshpan et al., 1959; Watanabe and Grundfest, 1961).

2.4) Материалы

НаименованиеКоличество
Крупный речной рак (Procambarus clarkii)1
Прецизионные диссекционные ножницы1
Пинцет1
Камера для нерва MLT016/X1
Ноутбук с программным обеспечением Scope1
PowerLab1
Усилитель PowerLab1
Выходной кабель стимулятора для PowerLab1
USB-разъем PowerLab/компьютер1
Стойка манипулятора с вакуумным электродом1
Стеклянная пипетка с грушей1
Стакан с физиологическим раствором для раков1

2.5) Методы

2.5.1) Диссекция

Перед тем как приступать к вивисекции рака, убедитесь, что чашка для нервов, необходимые инструменты и растворы подготовлены.

  1. Оберните рака во влажное бумажное полотенце для фиксации или просто удерживайте рака одной рукой, зажав клешни (хелипеды) между большим и указательным пальцами.
  2. Другой рукой сделайте надрез ножницами через рострум между глазными впадинами.
    Процесс диссекции рака с использованием ножниц, анатомическое исследование, биологическое обучение.
  3. Делайте разрез вниз от надреза до полного отделения головы.
  4. Сделайте надрез у основания головогруди над брюшком; удалите хвост. (При необходимости можно удалить хелипеды и ходильные ноги, чтобы облегчить этот процесс).
    Процесс диссекции насекомого в ходе анатомического лабораторного эксперимента с установкой для микроскопического исследования.
  5. Удалите плеоподы.
    Анатомическая диссекция скорпиона, фокус на структуре экзоскелета, демонстрация клешней и сегментированного тела.
  6. Сделайте разрез вдоль обеих сторон вентральной стороны брюшка. Будьте осторожны, чтобы не повредить более глубокие ткани.
    Диссекция насекомого; исследование анатомии личинки; лабораторный эксперимент со скальпелем; образовательное исследование.
  7. Отогните освобожденную часть экзоскелета до основания хвостового веера, чтобы обнажить вентральный нервный шнур.
    Процесс диссекции беспозвоночного; биологический эксперимент; анатомическое исследование; метод исследования.
  8. Используя край пинцета, осторожно захватите вентральный нервный шнур за кончик и извлеките его. Будьте осторожны, чтобы не растянуть и не раздавить нервный шнур. (Любые узелки, наблюдаемые на нервном шнуре, являются ганглиями рака).
    Гидродинамика в статическом равновесии, микроорганизм, под водой, научное наблюдение, диаграмма.
  9. Разложите нервный шнур на металлических перекладинах в нервной камере. Крайне важно поддерживать вентральный нервный шнур во влажном состоянии. Для этого добавьте в нервную камеру достаточное количество физиологического раствора для раков, чтобы уровень жидкости сравнялся с металлическими перекладинами. Затем с помощью пипетки удалите часть раствора так, чтобы уровень жидкости едва касался нижней части перекладин.
    Физиологический раствор для раков (mM: 205 NaCl; 5.3 KCl; 13.5 CaCl2.2H2O; 2.45 MgCl2.6H2O; 5 HEPES, доведенный до pH 7.4)
  10. После размещения нерва подключите кабель стимулятора с двумя мини-крючками к нервной камере. Прикрепите положительный красный вывод к одной из внешних металлических петель у конца нервного шнура; прикрепите отрицательный черный вывод к ближайшей соседней металлической петле, которая все еще контактирует с нервным шнуром.
    Оптическое возбуждение в установке для спектроскопии; фотонный анализ; исследование эмиссии и абсорбции.
  11. Расположите вакуумный электрод в манипуляторе рядом с противоположным концом нерва.
  12. Осторожно втяните кончик вентрального нервного шнура в регистрирующий электрод.

2.5.2) Запись

После того как кончик нервного ствола будет затянут в записывающий электрод, убедитесь, что электрод прикреплен к зонду, а зонд достаточно заземлен. Это можно сделать, просто подсоединив заземляющий кабель к клетке Фарадея. Провода положительного и отрицательного всасывающих электродов также должны быть подсоединены к соответствующим портам зонда. Зонд следует подключить к дифференциальному усилителю, который, в свою очередь, подключен к системе PowerLab.
Установка для нейробиологического эксперимента с клеткой Фарадея, микроскопом, электродами и системой усиления.

Подключите электрические провода от вакуумного электрода к головному усилителю. Провода должны быть подключены следующим образом: красный (положительный) — сверху слева, зеленый (заземление) — посередине, черный (отрицательный) — снизу. Это показано на рисунке 10 для головного усилителя ниже. Провод заземления можно просто поместить в солевой раствор. Таким образом, один провод от вакуумного электрода подключается к входу +, а другой — к входу -. Не имеет значения, какой из проводов вакуумного электрода идет к входу + или -.
Диаграмма символов электрического заряда; положительный и отрицательный знаки, зеленый индикатор.
Рисунок 10: Входы головного усилителя

Настройки усилителя следующие:

КОНТРОЛЬОБСТАНОВКА
Фільтр высоких частотпост. ток
Режекторный фильтрВЫКЛ
Низкочастотный фильтр20 кГц
Сравнение емкостиПротив часовой стрелки
Ручка точной и грубой настройки смещения постоянного токаПротив часовой стрелки
Смещение постоянного тока (+ВЫКЛ)ВЫКЛ
Ручка регулировки усиления50
Вход (ДИФФ МОНО ЗАЗ)Дифференциальный анализ (DIFF)
РЕЖИМ (СТИМУЛЯЦИЯ-ШЛЮЗ-РЕГИСТРАЦИЯ)GATE
ΩТЕСТВЫКЛ

Подключите прилагаемый USB-кабель к задней панели PowerLab и к разъему компьютера. Запустите программное обеспечение Scope на рабочем столе компьютера. В правом верхнем углу экрана выберите «Channel 2» и отключите его. Отрегулируйте экран так, чтобы отображался только Channel 1, переместив разделительную полосу в центре экрана вниз. Затем нажмите на «Input Amplifier» для канала 1 в правом верхнем углу экрана. Выберите следующие параметры:

ЭЛЕМЕНТ УПРАВЛЕНИЯНАСТРОЙКА
ДИАПАЗОН500 mV
ACОТМЕЧЕНО
ФНЧВЫКЛ
ОДНОКОНЦЕВОЙ РЕЖИМОТМЕЧЕНО
ИНВЕРСИЯОТМЕЧЕНО

Затем снова в разделе «Set up» нажмите «Sampling». В появившемся окне в поле «Sweep» выберите следующие параметры:

КОНТРОЛЬОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ
РЕЖИММНОЖЕСТВЕННЫЙ
ОБРАЗЕЦ100 сканирований
Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода.Пожалуйста, предоставьте текст для перевода.
ЗАДЕРЖКА0 СЕКУНД

Наконец, на вкладке «Set up» выберите «Stimulator». Снимите флажок с пункта «Isolated Stim». Выберите следующие настройки:

КОНТРОЛЬОБСТАНОВКА
РЕЖИММНОЖЕСТВЕННЫЙ
ЗАДЕРЖКА5 мс
ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ1 мс
ИМПУЛЬС(Ы)2
ИНТЕРВАЛ15 мс
ДИАПАЗОН5 В
АМПЛИТУДА0.5
  
  

См. раздел «Time Base» («Временная база») на правой панели. Измените значение «Sample» («Выборка») на 1024, а «Time» («Время») — на 200 msec.

График электрофизиологических исследований, потенциал действия, скачок напряжения, анализ данных, результат исследования.
Рисунок 11: Два сложных потенциала действия с интервалом 15 msec между стимулами, зарегистрированные с помощью программного обеспечения Scope.

Упражнение 1.

Нажмите кнопку «Start» в левом нижнем углу экрана. При указанных выше настройках в окне сбора данных осциллографа должен появиться четко выраженный суммарный потенциал действия (Рисунок 11). Зарисуйте общую форму потенциала действия на графике ниже (Рисунок 12):
График статического равновесия, диаграмма зависимости напряжения от времени, отображающая изменения mV за миллисекунды.
Рисунок 12: Пустой график для зарисовки формы суммарного потенциала действия.

Медленно уменьшайте напряжение с помощью вкладки в верхнем левом углу экрана. Амплитуда потенциала действия должна снижаться до тех пор, пока его характерная форма волны не исчезнет. Снижение напряжения уменьшает количество нейронов, которые вовлекаются в генерацию суммарного потенциала действия. Вероятно, при более низких напряжениях вовлекаются крупные аксоны, которые обладают более высокой скоростью проведения и, следовательно, первыми проявляются в суммарном потенциале действия. Постепенно увеличивайте напряжение, чтобы наблюдать противоположный эффект; по мере вовлечения большего числа нейронов волна суммарного потенциала действия становится больше. Данное упражнение иллюстрирует тот факт, что отдельные нейроны имеют разные пороги генерации потенциала действия. Когда суммарный потенциал действия перестает расти при дальнейшем увеличении стимулирующего напряжения, это означает, что все нейроны были вовлечены; на экране компьютера должны стать видны два отчетливых пика волны потенциала действия.

Упражнение 2.

После изучения рекрутирования нейронов и результирующего суммарного потенциала действия пронаблюдайте эффект рефрактерного периода. Это можно сделать, подавая два стимула с коротким временным интервалом и изменяя интервал между стимулами, чтобы определить, при каком интервале амплитуда суммарного потенциала действия, вызванного вторым стимулом, снижается по сравнению с первым суммарным потенциалом действия. Изменяйте задержку между импульсами с помощью вкладки в верхнем левом углу экрана. Продолжайте сокращать задержку до тех пор, пока второй суммарный потенциал действия перестанет возникать. Время между импульсами, при котором второй потенциал действия больше не возбуждается, называется абсолютным рефрактерным периодом. Время от окончания абсолютного рефрактерного периода до момента, когда второй стимул вызывает потенциал действия с полной амплитудой, называется относительным рефрактерным периодом. Укажите приблизительные значения абсолютного и относительного рефрактерных периодов в отведенных полях.
Абсолютный рефрактерный период: ___________________
Относительный рефрактерный период: ___________________

2.5.3) Измерение скорости проведения

С помощью миллиметровой линейки измерьте расстояние между стимулирующим электродом, расположенным ближе всего к регистрирующему электроду, и самим регистрирующим электродом. На основании зарегистрированной кривой измерьте время до различных пиков событий в суммарном потенциале, чтобы рассчитать скорость проведения различных электрических сигналов. Переведите расстояние из мм в метры, а время из msec в сек, чтобы получить единицы измерения м/с.
Скорость проведения 1й формы волны: __________________
Скорость проведения 2й формы волны: __________________
Скорость проведения 3й формы волны: __________________
Скорость проведения 4й формы волны: __________________

2.5.4) Манипуляции с щелевыми контактами и/или скоростью проведения

Далее исследуйте свойства нейронального ингибитора. Эффект разобщения, вызываемый гептанолом, был впервые описан Джонстоном et al. (1980) в септальных аксонах (т. е. щелевых контактах) речного рака. Этот эффект, связанный с электрической коммуникацией, вскоре был подтвержден в различных системах позвоночных и беспозвоночных (Bernardini et al., 1984; Meda et al., 1986). Чтобы понять роль электрической коммуникации в данном вентральном нервном шнуре, для разобщения щелевых контактов можно использовать физиологический раствор с (1mM) 1-гептанолом. С помощью стеклянной пипетки промойте весь нервный шнур раствором гептанола. Пронаблюдайте за изменениями, фиксируемыми программным обеспечением Scope, и резюмируйте их (обратите внимание на изменение формы волны и на то, изменилась ли скорость проведения этих волн). В качестве альтернативы вместо использования 1-гептанола можно заменить раствор для погружения ледяным физиологическим раствором и отследить любые изменения формы волны или скорости её проведения.

Обсуждение

Наша цель в режиме он-лайн видео-презентации и данной статьи является показать, что биофизические свойства клеток можно, в частности, быть смоделирована как электрических цепей. Кроме того, с живой нервной ткани, который относительно легко получить, основополагающие принципы скорости проведения, рефрактерных периодов и электрофизиологических методов записи возможны для студентов лаборатории студент со скромными инвестициями оборудования. Темы и основные парадигмы представлены может быть легко модифицирована для потребностей различных курсах.

Техническое обслуживание раков и их изобилие делает их привлекательными моделями для студентов управляемых экспериментов. Ракообразных вентральной нервные стволы, как правило, надежные и сохранять физиологическую целостность в минимальные физиологический раствор в течение часа, что достаточно для 3 часов студент лаборатории.

Учитывая, что некоторые из больших аксонов в VNC из раков подключены через щелевые контакты, дополнительные эксперименты на их вклад может быть проведен, а также различные свойства, чем в стандартной лягушки седалищный нерв подготовки может быть доказана. Седалищного нерва является классической моделью для решения соединения потенциалов действия и проводимости свойствами. Это могло бы даже быть интересным сравнительный эксперимент для студентов, чтобы сравнить свойства проводимости, аксон найма, и тугоплавких периоды между этими двумя препаратами.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Эти эксперименты были изменены из лаборатории руководство, которое было использовано в курсе, организованная доктором HL Этвуд, на кафедре зоологии Университета Торонто. Упражнения были также использованы и модифицированы от руководства, которое было произведено для "6-й ИНТЕНСИВНЫЙ СЕМИНАР ПО ОСНОВНЫМ МОИМ Neuroscience" и был проведен в Корейский университет, Сеул, Южная Корея в 1993 году (Cooper и соавт., 1993). Текущие изменения должны были использовать оборудование общего и по сей день студента направлены лабораторий в различных университетах. Поддержке Университета Кентукки, биологический факультет, Управление бакалавриата и колледж искусств и наук.

Материалы

Монтажная плата

  1. Электроника, перечисленные ниже для макетов экспериментов можно получить в местном магазине электроники, такие как Radio Shack.
  2. Хлеб платы, резисторы, конденсаторы, аккумуляторы и провода, которые могут служить в качестве соединения для макета, как указано в экспериментах.
  3. Общие вольтметр (Wavetek Meterman вольтметр)
  4. / D борту на линии записи на компьютер. Электрические сигналы, записанные на линии интерфейса PowerLab/4s (ADInstruments, Колорадо Спрингс, Колорадо, США). Мы используем стандартное программное обеспечение от имени ADInstruments Диаграмма или область.

Физиология экспериментов

  1. Раки (Procambarus clarkii). Атчафалайя Биологические питания Ко, Raceland, Лос-Анджелесе., США.
  2. Стандартный раков солевых: Модифицированная из раствора Ван Harreveld (1936). (В мм) 205 NaCl, 5,3 KCl; 13,5 CaCl 2 2H 2 O; 2,45 MgCl 2 6H 2 O, 5 HEPES и доводят до рН 7,4. Все солевой химических веществ были получены от Sigma Chemical Company (Сент-Луис, Миссури).
  3. Dissection инструменты: Fine # 5 пинцет, ножницы штраф, держатель ножа, # 26002-20 насекомых штифты (все полученные от изобразительных инструментов науки (США), Inc, 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139)
  4. Блюдо нерва камеры (ADInstruments, Колорадо-Спрингс, Колорадо, США) для проведения нерва. Провода, которые идут с камерой блюдо нерва может быть использован для стимуляции нерва.
  5. Всасывающего электрода используется для записи сигналов.
  6. Манипулятором или зажим на кольце стенде будет также служить в качестве держателя для всасывающего электрода.
  7. Экранированная камера
  8. Препаровальная лупа
  9. Высокая интенсивность осветитель (источник света)
  10. Микроскоп платформы
  11. AC / DC дифференциального усилителя (АМ Systems, Inc Модель 3000)
  12. PowerLab 26Т (AD Instruments)
  13. Внеклеточный усилителя (AD Instruments)
  14. LabChart 7 (ADI Instruments)
  15. Пройдя инструменты
  16. Кольцо стоять и зажим в качестве держателя для электродов всасывания записи

Ссылки

  1. Bennett, M. V. L., Barrio, L. C., Bargiello, T. A., Spray, D. C., Hertzberg, E., Sdez, J. C. Gap junctions: new tools, new answers, new questions. Neuron. 6, 305-320 (1991).
  2. Bernardini, G., Peracchia, C., Peracchia, L. L. Reversible effects of heptanol on gap junction structure and cell-to-cell electrical coupling. European Journal of Cell Biology. 34 (2), 307-312 (1984).
  3. A report on the, "SIXTH INTENSIVE IBRO WORKSHOP ON BASIC NEUROSCIENCE". Cooper, R. L., Chang, J. J., Ito, M. July 1993, Seoul, South Korea, , Society for Neuroscience. 116-116 (1985).
  4. Cragg, B. G., Thomas, P. K. The relationship between conduction velocity and the diameter and internodal length of peripheral nerve fibers. Journal of Physiology. 136, 606-614 (1957).
  5. Erlanger, J. G. asser, S, H., Bishop, G. H. The compound nature of the action current of nerves as disclosed by the cathode ray oscillograph. American Journal of Physiology. 70, 624-666 (1924).
  6. Furshpan, E. J., Potter, D. D. Transmission at the giant motor synapses of the crayfish. Journal of Physiology. 145 (2), 289-325 (1959).
  7. Johnston, M. F., Simon, S. A., Ramrn, F. Interaction of anesthetics with electrical synapses. Nature (Lond). 286, 498-500 (1980).
  8. Loewenstein, W. R. Permeability of membrane junctions. Annual NY Academy of Sciences. 137, 441-472 (1966).
  9. Meda, P., Bruzzone, R., Knodel, S., Orci, L. Blockage of cell-to-cell communication within pancreatic acini is associated with increased basal release of amylase. Journal of Cell Biology. 103 (2), 475-483 (1986).
  10. Peracchia, C. Increase in gap junction resistance with acidification in crayfish septate axons is closely related to changes in intracellular calcium but not hydrogen ion concentration. Journal of Membrane Biology. 113 (1), 75-92 (1990).
  11. Peracchia, C., Dulhunty, A. F. Low resistance junctions in crayfish: structural changes with functional uncoupling. Journal of Cell Biology. 70, 419-439 (1976).
  12. Peracchia, C., Bernardini, G., Peracchia, L. L. Is calmodulin involved in the regulation of gap junction permeability. Pfügers Arch. 399, 152-154 (1983).
  13. Peracchia, C., Lazrak, A., Peracchia, L. L. Molecular models of channel interaction and gating in gap junctions. Handbook of Membrane Channels. Molecular and Cellular Physiology. Peracchia, C. , Academic Press. San Diego. 361-377 (1994).
  14. Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. L. Gap junctional conductance is a simple and sensitive function of intracellular pH. Sciences NY. 211, 712-715 (1981).
  15. Spray, D. C., Harris, L. L., Bennett, M. V. L. Comparison of pH and Ca dependence of gap junctional conductance. Intracellular pH: Its Measurement, Regulation, and Utilization in Cellular Functions. Nuccitelli, R., Deamer, D. , Alan R. Liss. New York. 445-461 (1982).
  16. Spray, D. C., White, R., De Carvalho, C., Harris, A. L., Bennett, M. L. V. Gating of gap junction channels. Journal of Biophysics. 45, 219-230 (1984).
  17. Watanabe, A., Grundfest, H. Impulse propagation at the septal and commissural junctions of crayfish lateral giant axons. Journal of General Physiology. 45, 267-308 (1961).
  18. Wiersma, C. A. G., Hughes, G. M. On the functional anatomy of neuronal units in the abdominal cord of the crayfish, Procambarus clarkii. Journal of Comparative Neurology. 116, 209-228 (1961).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи