Мы предоставляем шаг за шагом протокол для цельноклеточной патч зажим записи кальция Release-активированный кальций (CRAC) токов в периферической крови мононуклеарных клеток происхождения человека Т-лимфоцитов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Всего-Cell Запись Кальций Release-активированный кальций (CRAC) Токи в лимфоцитах человека Т
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В Т-лимфоциты, истощение Са 2 + из внутриклеточных Са 2 + магазине приводит к активации plasmalemmal Ca 2 + каналы, называемые Кальций Release-активированный кальций (CRAC) каналов. CRAC каналы играют важную роль в регуляции клеточной пролиферации Т и экспрессии генов. Аномальные канал CRAC функции Т-клеток была связана с тяжелым комбинированным иммунодефицитом и аутоиммунных заболеваний, 1, 2. Изучение CRAC функцию канала в человеческих Т-клеток может раскрыть новые молекулярные механизмы, регулирующие нормальный иммунный ответ и раскрыть причины человека, связанных с заболеваниями. Электрофизиологические записи мембранных токов обеспечивают наиболее точную оценку функциональных свойств канала и их регулирование. Электрофизиологические оценки CRAC токов канала в Jurkat Т-клетки, лейкемии человека Т-клеток линии, была впервые исполнена более чем 20 лет назад 3, однако, CRAC измерения тока в нормальных человеческих Т-клеток остается сложной задачей. Трудности в записи токов CRAC канала в нормальных клетках Т усугубляется тем, что кровь полученных Т-лимфоцитов значительно меньше по размеру, чем Jurkat Т-клеток и, таким образом, эндогенные цельноклеточная токов CRAC очень низкие по амплитуде. Здесь мы даем шаг за шагом процедуры, которые мы обычно используем для записи Са 2 + и Na + токи через CRAC каналов в состоянии покоя человека Т-клеток выделенных из периферической крови здоровых добровольцев. Метод, описанный здесь, был принят от процедур, используемых для записи CRAC токов в Jurkat Т-клеток и активированных Т-клетках человека 4-8.
Протокол
1. Подготовка Отдых правам Т-лимфоцитов
- Использование RosetteSep правам Т-клеток Коктейль по обогащению и среднего RosetteSep Плотность, очистить Т-клеток из человеческих образцов крови в соответствии с инструкциями производителя. В результате клеточной популяции должна содержать 95% CD3 + Т-клеток отдыха. Мы очищаем человека Т-лимфоцитов из периферической крови собранных от здоровых добровольцев в соответствии с протоколом, утвержденным Советом UC Davis Внутренняя проверка.
- После изоляции, ресуспендируют отдыха Т-клеток при плотности 0,5 х 10 6 клеток / мл в ячейку культуральной среде, содержащей RPMI-1640 с глютамином и HE....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Электрофизиологические исследования CRAC токи в состоянии покоя человека Т-клеток является сложной задачей, поскольку эндогенный CRAC амплитуды тока в этих клетках мало из-за небольшого размера ячейки (отдыха человека Т-клеток диаметром в диапазоне 5-8 мкм). Здесь мы представляем шаг за шагом процедуры надежно записи CRAC токи в состоянии покоя человека Т-лимфоциты изолированы от мононуклеарных клеток периферической крови. Эта технология позволяет исследовать физиологию и функциональные выражения CRAC каналов в состояни.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Мы благодарны кафедры физиологии и мембранной биологии Калифорнийского университета Дэвиса за предоставление нам помещения и отличные условия для исследования ионных каналов.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Коктейль для обогащения Т-клетками человека RosetteSep | Технологии стволовых клеток | 15061 | |
| Плотностная среда RosetteSep | Технологии стволовых клеток | 15705 | |
| среда RPMI-1640 с глутамином и HEPES | Fisher Scientific | SH3025501 | |
| Фетальная бычья сыворотка | Omega Scientific | FB-01 | |
| GlutaMAX-I (100-кратный раствор) | Invitrogen | 35050 | |
| витаминный раствор для среды RPMI 1640 (100X) | Sigma-Aldrich | 7256 | |
| раствор аминокислот для среды 1640 (50X) | Sigma-Aldrich | R7131 | |
| Пируват натрия | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| β-меркапто–этанол | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| Инозитолтрифосфат | Sigma-Aldrich | 19766 | |
| BAPTA | Sigma-Aldrich | A4926 | |
| Гидробромид поли-L-лизина | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Хлорид лантана | Sigma-Aldrich | 262072 | |
| Тапсигаргин | Calbiochem | 586005 | |
| Набор силиконового эластомера Sylgard 184 | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| Защитное покрытие для полупроводников HIPEC R6101 | Dow Corning | ||
| Лабораторный виброизоляционный стол серии 63-500 с высокими эксплуатационными характеристиками | Technical Manufacturing Corp. | 63-540 | |
| Усилитель для локальной фиксации потенциала (patch-clamp) EPC 10 с головным усилителем | HEKA Instruments | ||
| Микроманипулятор | Sutter Instrument Co. | MP-285 | |
| Инвертированный микроскоп Olympus 1X71 с масляным иммерсионным объективом 40x | Olympus Corporation | 1X71 | |
| Компьютер с ОС Windows | Dell | ||
| Программное обеспечение Pulse | HEKA Instruments | ||
| Программное обеспечение для построения графиков и анализа данных Origin Scientific | OriginLab | ||
| Вытяжка патч-пипеток | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Боросиликатное стекло с нитью (наружный диаметр: 1,5 мм, внутренний диаметр: 1,10 мм) | Sutter Instrument Co. | BF150-110-7.5 | |
| Narashige’s Microforge | Tritech Research, Inc. | MF-830 | |
| Силиконовые уплотнительные кольца | McMaster-Carr | 111 S70 | |
| Покрывные стекла 25 мм | Fisher Scientific | 12-545-102 25 мм 25CIR.-1 |
Ссылки
- Parekh, A. B. Store-operated CRAC channels: function in health and disease. Nat Rev Drug Discov. 9, 399-410 (2010).
- Feske, S. CRAC channelopathies. Pflugers Arch. , (2010).
- Lewis, R. S., Cahalan,
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
