Данная статья описывает быстрый протокол эффективно изолировать мононуклеарных клеток из головного и спинного мозга ткани, которые могут быть эффективно использованы для проточной цитометрии анализа.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение головного и спинного мозга одноядерных клеток Использование Перколла Градиенты
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Выделение иммунные клетки, которые проникают в центральную нервную систему (ЦНС), во время инфекции, травмы, аутоиммунные заболевания или нейродегенерации, часто требуется, чтобы определить их фенотип и эффекторные функции. Гистохимические подходы играют важную роль для определения расположения проникновения клеток и исследованы соответствующие патологии ЦНС. Тем не менее, на месте гистохимии и иммунофлуоресцентного методы окраски ограничено количество антител, которые могут быть использованы за один раз, чтобы характеризовать иммунную подтипов ячейку в определенной ткани. Таким образом, гистологические подходов в сочетании с иммунной фенотипирование методом проточной цитометрии имеют решающее значение для полного описания состава местной инфильтрационной ЦНС. Этот протокол основан на разделении ЦНС сотовой надстройки над discontinous Перколла градиентов. Данная статья описывает быстрый протокол эффективно изолировать мононуклеарных клеток из головного и спинного мозга ткани, которые могут быть эффективно использованы для идентификации различных иммунных клеточных популяций в одном образце с помощью проточной цитометрии.
Протокол
Подготовка реагентов
Подготовка акции изотонический Перколла (SIP), 4 мл на мозг, путем смешивания 9 частей Перколла с одной частью 10X HBSS без Ca + + и Mg + +.
Подготовка SIP на 70% в 1X HBSS без Ca + + и Mg + +, 2 мл на мозг обойтись в 15 мл полипропилен конической трубе.
Примечание: Рекомендуется, чтобы Перколла должны использоваться при комнатной температуре, если они используются холодные, клетки имеют тенденцию группироваться и сотовый разделение менее эффективным.
Коллекция тканей и гомогенизации
Обезболить мышей и залив....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Анализ поверхности клеток маркеры в ЦНС лейкоцитов из нормальных и воспаленных тканях мышей был использован в течение нескольких десятилетий 1-3. Изоляция протоколы основаны на разделении микроглии и лейкоцитов по плотности 4 центрифугирования. Здесь мы опишем быстрый и эффективный метод выделения ЦНС лейкоцитов использовании разрывных градиенты Перколла. После выделения клеток при окраске различные антитела, такие как, но не ограничиваясь-CD45, CD4, CD8, CD11b, CD19 и т.д. позволяет идентифицирова.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке Национального общества рассеянного склероза (TA 3021-A1 / T для AEC) и Техасского университета в Сан-Антонио.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
Гомогенизации тканей и градиенты
- Перколла (Amersham)
- Сбалансированный Соль 10X Хэнкса решение, без кальция и магния (Gibco)
- Средний RPMI 1640, без фенола красного (Gibco)
- 7-мл или 15 мл Dounce тканей Измельчители (VWR)
Проточная цитометрия
- Сотовые Окрашивание Buffer (Biolegend)
- Очищенная Крыса антимышиным CD16/CD32 (мышь BD Fc Block), BD Pharmingen
- Hemacytometer (Fisher)
- Анти-CD45 мыши (клон 30-F11), CD4 (клон RM4-5), CD19 (клон 6D5), BioLegend
- 10 раз фосфатным буферным солевым раствором, без кальция и магния (Thermo Scientific)
- Параформальдегид (Sigma Aldrich)
- Анализ проточной цитометрии осуществляется с LSR II (BD Biosciences)
Ссылки
- Sedgwick, J. D. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 7438-7442 (1991).
- Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
