$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Подготовка реагентов
Подготовка акции изотонический Перколла (SIP), 4 мл на мозг, путем смешивания 9 частей Перколла с одной частью 10X HBSS без Ca + + и Mg + +.
Подготовка SIP на 70% в 1X HBSS без Ca + + и Mg + +, 2 мл на мозг обойтись в 15 мл полипропилен конической трубе.
Примечание: Рекомендуется, чтобы Перколла должны использоваться при комнатной температуре, если они используются холодные, клетки имеют тенденцию группироваться и сотовый разделение менее эффективным.
Коллекция тканей и гомогенизации
Обезболить мышей и заливать через левый желудочек с ледяной 1X HBSS. Рассеките головной и спинной мозг и поддерживать в RPMI без фенола красного, пока все мыши были принесены в жертву.
Место тканей в 7 или 15 мл Dounce гомогенизатор, содержащий 3 мл RPMI, мягко сделать клеточной суспензии с свободную установку пестиком (размер), а затем Тай облегающие пестиком (B размера) в целях дальнейшего диссоциируют тканей. Полный объем клеточные суспензии до 7 мл RPMI.
Градиент создана
Добавьте 3 мл SIP к клеточной суспензии, чтобы сделать окончательные 30% SIP
Медленно слой 10 мл клеточной суспензии в верхней части 70% SIP. Это наиболее критический этап процедуры, используйте пипетку-аппарат установлен в гравитационном режиме избежать смешивания 70% и 30% растворы. Очень четко плоская линия должна быть видна на 70% -30% узел.
Центрифуга 30 минут при 500G 18 ° C. Убедитесь, что центрифуга остановится с минимальным или вообще не тормозить так, что межфазные не нарушается.
Использование передачи пипетки, аккуратно снимите слой мусора из верхней части трубки и собрать 2,0-3,0 мл 70% -30% межфазной в чистую коническую трубку с 8 мл 1X HBSS. Убедитесь, что Перколла содержащие межфазной разбавляют примерно в три раза, перемешать несколько раз инверсии и centrifugre 7 мин при 500G при 18 ° C.
Ресуспендируют гранул в 1 мл клеточной буфера окрашивания и перенести его на 1,5 мл трубки и промыть еще один раз, используя микро-центрифуге при 10000 G 1 мин при 4 ° C.
Антитела окрашивание
Ресуспендируют гранул в 50 мкл очищенной antimouse CD16/CD32 разбавленной 1:200 в ячейке буфера окрашивания блокировать Fc сайты связывания. Инкубируйте со льдом в течение 10 мин. Граф клеток с использованием гемоцитометра.
Добавить 50 мкл антител смешивать коктейль, а затем инкубируют на льду в течение 30 мин. Каждое антитело должно быть сначала титровали для оценки оптимального разведения. Используйте соответствующие флуорохромом комбинаций выбирается в зависимости возможностей лазерной и настройки фильтров от конкретной цитометр потока.
Вымойте клетки в ячейке окрашивания буфера, ресуспендируют гранулы в 100-200 мкл клеточной буфера окрашивания и анализа непосредственно в цитометр, или же клетки могут быть ресуспендировали в 2% параформальдегида (PFA), подготовленный в PBS и хранится в течение ночи при температуре 4 ° C .
Представитель Результаты:
После спиннинг градиенты, 70% -30% интерфазе должно иметь определенную белый ореол, и количественного определения клетки оправился от наивного мыши должны дать 3-5 x10 5 клеток на мышь (плюс мозг спинной мозг). Воспаление мозга, возможно, начиная количества воспалительных клеток в зависимости от ЦНС оскорбление или модели заболевания (рис. 1).
Рисунок 1. Выделение мононуклеарных клеток, от наивных и EAE мозга на пике болезни. Клетки мозга суспензий были разделены на разрывной 70% / 30% градиенты Перколла. Клетки окрашивали инкубировали с Fc-блок следуют анти-CD45 антител в течение 30 мин на льду. Клетки промывали в ячейке буфера окрашивания, и фиксируется в 2% PFA до приобретения в ЛСР-II. CD45 интенсивность измеряется в Y-оси, где три отдельные популяции визуализируются. Дальнейшая характеристика иммунной фенотип CD45 привет проникают клетки осуществляется с помощью дополнительных антител, а затем анализировали с помощью проточной цитометрии.