Данная статья описывает быстрый протокол эффективно изолировать мононуклеарных клеток из головного и спинного мозга ткани, которые могут быть эффективно использованы для проточной цитометрии анализа.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение головного и спинного мозга одноядерных клеток Использование Перколла Градиенты
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Выделение иммунные клетки, которые проникают в центральную нервную систему (ЦНС), во время инфекции, травмы, аутоиммунные заболевания или нейродегенерации, часто требуется, чтобы определить их фенотип и эффекторные функции. Гистохимические подходы играют важную роль для определения расположения проникновения клеток и исследованы соответствующие патологии ЦНС. Тем не менее, на месте гистохимии и иммунофлуоресцентного методы окраски ограничено количество антител, которые могут быть использованы за один раз, чтобы характеризовать иммунную подтипов ячейку в определенной ткани. Таким образом, гистологические подходов в сочетании с иммунной фенотипирование методом проточной цитометрии имеют решающее значение для полного описания состава местной инфильтрационной ЦНС. Этот протокол основан на разделении ЦНС сотовой надстройки над discontinous Перколла градиентов. Данная статья описывает быстрый протокол эффективно изолировать мононуклеарных клеток из головного и спинного мозга ткани, которые могут быть эффективно использованы для идентификации различных иммунных клеточных популяций в одном образце с помощью проточной цитометрии.
Протокол
Подготовка реагентов
Подготовка акции изотонический Перколла (SIP), 4 мл на мозг, путем смешивания 9 частей Перколла с одной частью 10X HBSS без Ca + + и Mg + +.
Подготовка SIP на 70% в 1X HBSS без Ca + + и Mg + +, 2 мл на мозг обойтись в 15 мл полипропилен конической трубе.
Примечание: Рекомендуется, чтобы Перколла должны использоваться при комнатной температуре, если они используются холодные, клетки имеют тенденцию группироваться и сотовый разделение менее эффективным.
Коллекция тканей и гомогенизации
Обезболить мышей и заливать через левый желудочек с ледяной 1X HBSS. Рассеките головной и спинной мозг и поддерживать в RPMI без фенола красного, пока все мыши были принесены в жертву.
Место тканей в 7 или 15 мл Dounce гомогенизатор, содержащий 3 мл RPMI, мягко сделать клеточной суспензии с свободную установку пестиком (размер), а затем Тай облегающие пестиком (B размера) в целях дальнейшего диссоциируют тканей. Полный объем клеточные суспензии до 7 мл RPMI.
Градиент создана
Добавьте 3 мл SIP к клеточной суспензии, чтобы сделать окончательные 30% SIP
Медленно слой 10 мл клеточной суспензии в верхней части 70% SIP. Это наиболее критический этап процедуры, используйте пипетку-аппарат установлен в гравитационном режиме избежать смешивания 70% и 30% растворы. Очень четко плоская линия должна быть видна на 70% -30% узел.
Центрифуга 30 минут при 500G 18 ° C. Убедитесь, что центрифуга остановится с минимальным или вообще не тормозить так, что межфазные не нарушается.
Использование передачи пипетки, аккуратно снимите слой мусора из верхней части трубки и собрать 2,0-3,0 мл 70% -30% межфазной в чистую коническую трубку с 8 мл 1X HBSS. Убедитесь, что Перколла содержащие межфазной разбавляют примерно в три раза, перемешать несколько раз инверсии и centrifugre 7 мин при 500G при 18 ° C.
Ресуспендируют гранул в 1 мл клеточной буфера окрашивания и перенести его на 1,5 мл трубки и промыть еще один раз, используя микро-центрифуге при 10000 G 1 мин при 4 ° C.
Антитела окрашивание
Ресуспендируют гранул в 50 мкл очищенной antimouse CD16/CD32 разбавленной 1:200 в ячейке буфера окрашивания блокировать Fc сайты связывания. Инкубируйте со льдом в течение 10 мин. Граф клеток с использованием гемоцитометра.
Добавить 50 мкл антител смешивать коктейль, а затем инкубируют на льду в течение 30 мин. Каждое антитело должно быть сначала титровали для оценки оптимального разведения. Используйте соответствующие флуорохромом комбинаций выбирается в зависимости возможностей лазерной и настройки фильтров от конкретной цитометр потока.
Вымойте клетки в ячейке окрашивания буфера, ресуспендируют гранулы в 100-200 мкл клеточной буфера окрашивания и анализа непосредственно в цитометр, или же клетки могут быть ресуспендировали в 2% параформальдегида (PFA), подготовленный в PBS и хранится в течение ночи при температуре 4 ° C .
Представитель Результаты:
После спиннинг градиенты, 70% -30% интерфазе должно иметь определенную белый ореол, и количественного определения клетки оправился от наивного мыши должны дать 3-5 x10 5 клеток на мышь (плюс мозг спинной мозг). Воспаление мозга, возможно, начиная количества воспалительных клеток в зависимости от ЦНС оскорбление или модели заболевания (рис. 1).
Рисунок 1. Выделение мононуклеарных клеток, от наивных и EAE мозга на пике болезни. Клетки мозга суспензий были разделены на разрывной 70% / 30% градиенты Перколла. Клетки окрашивали инкубировали с Fc-блок следуют анти-CD45 антител в течение 30 мин на льду. Клетки промывали в ячейке буфера окрашивания, и фиксируется в 2% PFA до приобретения в ЛСР-II. CD45 интенсивность измеряется в Y-оси, где три отдельные популяции визуализируются. Дальнейшая характеристика иммунной фенотип CD45 привет проникают клетки осуществляется с помощью дополнительных антител, а затем анализировали с помощью проточной цитометрии.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Анализ поверхности клеток маркеры в ЦНС лейкоцитов из нормальных и воспаленных тканях мышей был использован в течение нескольких десятилетий 1-3. Изоляция протоколы основаны на разделении микроглии и лейкоцитов по плотности 4 центрифугирования. Здесь мы опишем быстрый и эффективный метод выделения ЦНС лейкоцитов использовании разрывных градиенты Перколла. После выделения клеток при окраске различные антитела, такие как, но не ограничиваясь-CD45, CD4, CD8, CD11b, CD19 и т.д. позволяет идентифицирова...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке Национального общества рассеянного склероза (TA 3021-A1 / T для AEC) и Техасского университета в Сан-Антонио.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
Гомогенизации тканей и градиенты
- Перколла (Amersham)
- Сбалансированный Соль 10X Хэнкса решение, без кальция и магния (Gibco)
- Средний RPMI 1640, без фенола красного (Gibco)
- 7-мл или 15 мл Dounce тканей Измельчители (VWR)
Проточная цитометрия
- Сотовые Окрашивание Buffer (Biolegend)
- Очищенная Крыса антимышиным CD16/CD32 (мышь BD Fc Block), BD Pharmingen
- Hemacytometer (Fisher)
- Анти-CD45 мыши (клон 30-F11), CD4 (клон RM4-5), CD19 (клон 6D5), BioLegend
- 10 раз фосфатным буферным солевым раствором, без кальция и магния (Thermo Scientific)
- Параформальдегид (Sigma Aldrich)
- Анализ проточной цитометрии осуществляется с LSR II (BD Biosciences)
Ссылки
- Sedgwick, J. D. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 7438-7442 (1991).
- Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity. J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154, 4309-4321 (1995).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Juedes, A. E., Ruddle, N. H. Resident and infiltrating central nervous system APCs regulate the emergence and resolution of experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Immunol. 166, 5168-5175 (2001).
- Prinz, M., Priller, J. Tickets to the brain: Role of CCR2 and CX(3)CR1 in myeloid cell entry in the CNS. J Neuroimmunol. , (2010).
- Mildner, A. Microglia in the adult brain arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nat. Neurosci. 10, 1544-1553 (2007).
- Djukic, M. Circulating monocytes engraft in the brain, differentiate into microglia and contribute to the pathology following meningitis in mice. Brain. 129, 2394-2403 (2006).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
