Повторение ионный канал Кривая IV Использование частотных составляющих

Краткое содержание

Есть технические препятствия для измерения тока потока через несколько ионных каналов одновременно, а затем и взыскательных, какая часть трансмембранного тока из-за каждого канала типа. Чтобы удовлетворить эту потребность, этот метод представляет собой способ создания кривой IV отдельных видов канал с помощью конкретных частотных составляющих.

Аннотация

ВВЕДЕНИЕ: В настоящее время не существует общепринятых методов одновременного измерения нескольких типов ионных каналов с разложением измеренного тока на составляющие, относящиеся к каждому типу канала. В данном исследовании демонстрируется, как импедансная спектроскопия может быть использована для определения конкретных частот, которые тесно коррелируют с амплитудой стационарного тока, измеренной в ходе экспериментов с фиксацией потенциала (voltage clamp). Метод заключается во внесении в протокол ступенчатого изменения напряжения шумовой функции, содержащей определенные частоты. В представленной работе используется модель клетки для демонстрации того, что цепи фиксации потенциала не вносят сильных корреляций, а также что сама шумовая функция не вызывает значимых корреляций при отсутствии ионных каналов. Эта валидация необходима перед применением метода к препаратам, содержащим ионные каналы. Целью представленного протокола является демонстрация способа характеристики частотного отклика одного типа ионного канала на шумовую функцию. После определения специфических частот для отдельного типа канала их можно использовать для воспроизведения вольт-амперной (IV) характеристики стационарного тока. Частоты, которые сильно коррелируют с одним типом канала и минимально — с другими, могут затем быть использованы для оценки вклада в ток нескольких типов каналов, измеряемых одновременно.

МЕТОДЫ: Измерения методом фиксации потенциала проводились на модельной клетке с использованием стандартного протокола ступенчатого изменения напряжения (-150 до +50 mV, шаг 5mV). В каждую ступень напряжения вводились шумовые функции, содержащие равные амплитуды частот в диапазоне 1-15 kHz (амплитуды от нуля до пика: 50 или 100mV). Для каждого значения потенциала ступени рассчитывалась действительная часть быстрого преобразования Фурье (БПФ) выходного сигнала в присутствии и в отсутствие шума. Величина каждой частоты как функция ступени напряжения коррелировала с амплитудой тока при соответствующих напряжениях.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ: В отсутствие шума (контроль) амплитуды всех частот, за исключением постоянной составляющей (DC), плохо коррелировали (|R|<0.5) с вольт-амперной (ВА) характеристикой, в то время как постоянная составляющая имела коэффициент корреляции более 0,999 во всех измерениях. Качество корреляции между отдельными частотами и ВА-характеристикой не изменилось при добавлении функции шума в протокол ступенчатого изменения напряжения. Аналогично, увеличение амплитуды функции шума также не привело к росту корреляции. Контрольные измерения показывают, что сама схема фиксации потенциала не вызывает высокой корреляции каких-либо частот выше 0 Hz со стационарной ВА-характеристикой. Точно так же измерения в присутствии функции шума демонстрируют, что при отсутствии ионных каналов функция шума не вызывает корреляции каких-либо частот выше 0 Hz со стационарной ВА-характеристикой. На основании данной проверки метод теперь может быть применен к препаратам, содержащим один тип ионных каналов, с целью идентификации частот, амплитуды которых специфически коррелируют с этим типом каналов.

Протокол

1. Подготовка Функция шума и входного сигнала

1. Создать шума функции, содержащей нужные компоненты частоты. Это может быть сделано путем описания желаемого частотных составляющих в частотной области, а затем расчета обратного быстрого преобразования Фурье. В этом исследовании, 1 - 15 кГц была использована. Все преобразования Фурье и обратное преобразование Фурье, описанных в данном исследовании, были рассчитаны с использованием БПФ Matlab и IFFT функций.
2. Шкала амплитуда шума функции надлежащим образом. В этом исследовании шума функция масштабируется так, что от нуля до пика амплитуды шума функция была 50 или 100 мВ.
3. Создать стимулы файл, используя методы подходят для приобретения программного обеспечения используется. Для CLAMPEX 8, сначала создайте текстовый файл с соответствующим заголовком. Ниже заголовка, вставка времени надбавок за одним движением в первой колонке. Приращениях времени должны иметь те же временные расстояния как интервал выборки, используемые в измерениях. Для каждой развертки в напряжении протокол шаг вставить точные напряжения желаемого на каждом шаге по времени. Это должно включать шум функции.

2. Выполните измерения напряжения зажим

1. Создание протокола измерений в приобретение программного обеспечения, совместимого с стимул файла, созданного ранее. В CLAMPEX, есть меню, которое позволяет пользователю связать стимул файл с текущего протокола.
2. Приложите модель (или биологическое) ячейки измерительного оборудования.
3. Выполните эксперимент, как запланировано. Для целей контроля, не забудьте включить периодических измерений, которые не содержат никакого шума функций.

3. Анализ Сообщение Эксперимент

1. Рассчитать кривую IV для отдельных записи. Если запись в равновесном состоянии, когда шум применяется функция, кривая IV можно создать с помощью устойчивая часть состояния записи временно за пределами диапазона шума функции. Если запись не была в равновесном состоянии, шум функция может вмешиваться в расчет кривой IV, так что вторая запись должна производиться без шума функция присутствует.
2. Для каждого напряжения шаг в записи расчета быстрого преобразования Фурье часть записи, где шум функция была вставлена. Комбинат преобразование Фурье для каждого напряжения шаг в amxn матрицы, где т-число частот в БПФ, а п-число ступеней напряжения. В этой конфигурации, каждая строка матрицы представляет собой амплитуду одной частоты на всех ступеней напряжения в эксперименте.
3. Для каждой частоты (то есть каждая строка в приведенном выше матрицы) коррелируют ряд с кривой IV генерируется в 3,1 и записывать коэффициент корреляции.
4. Участок против коэффициент корреляции частоты для визуализации частот, которые сильно коррелируют с кривой IV. Так как постоянная составляющая содержится в первой частоте БПФ, коэффициент корреляции для этой частоты должна всегда быть> 0,99.

4. Представитель Результаты:

Представитель измерения напряжения зажим показаны для модели клетки без (рис. 1А) и с (рис. 1В) шум функция вставляется в напряжении протокол шаг. Кривая IV был также рассчитаны для модели клетки (рис. 1в). Для каждой развертки, в записях из рисунка 1, БПФ был рассчитан по времени кадр, где шум функция была включена (см. красную коробку на рисунках 1А, 1Б). Цифры 2А и 2В показывают БПФ рассчитаны для записи показано на рисунке 1А и 1В, соответственно. После визуального осмотра, постоянная составляющая (выделено красным) появляется, чтобы имитировать форму кривой IV. Без шума функции, все частоты выше DC-видимому, амплитуда близка к нулю (рис. 2А). Когда шум Функция вставляется, частоты от 1 до 15 кГц имеют визуально заметные амплитуды (рис. 2В). На рисунке 3 показан результат соотнесения отдельных амплитуд частот в диапазоне напряжения шаги против кривой IV. На рис.3-C показывает, коэффициенты корреляции, когда эксперимент был проведен под контролем условиях (без шума функции) и с шумом амплитуды 50 и 100 мВ, соответственно. Обратите внимание, во всех случаях, постоянная составляющая появляется соотнести почти идеально совпадает с кривой IV. Действительно, для всех записей, коэффициент корреляции для этой частоты было больше, чем 0,99 (R = 0,9996 ± 1E-5, среднее ± стандартное отклонение). Когда мы смотрим на рисунок 3А (контроль условий), Есть нет частот, кроме постоянной составляющей, амплитуда которого значительно коррелирует с кривой IV. В частности, ни одна из этих частот имеют коэффициенты корреляции больше 0,5. При вставке из самых низких функцией амплитуды шума (50 мВ), эти же частоты еще коэффициентов корреляции менее 0,5. Коэффициенты корреляции длятаковой частоты также не стал более 0,5 когда амплитуда шума был увеличен до 100 мВ.

. Рисунок 1 Модель сотового Recordings: Напряжение записи зажима приведены для модели клетки без (1А) и с (1В) шума функции, включенные в протокол шагового напряжения. Для первых и последних 20 мс каждой развертки, потенциал сохранился на проведение потенциала (0 мВ). Каждый шаг был напряжением 80 мс долго, и шум функция была включена 40 мс после начала шаг. Функция шума был продолжительностью 30 мс и содержащиеся частотах от 1 до 15 кГц. Напряжение было шагнул в сторону, от -150 до +50 мВ в 5 мВ шагом. Кривая IV для модели ячейка также показано (1С). Для того, чтобы записи легче читать, только каждый пятый развертки был включен в 1А и 1В, но все это проносится были включены в 1С.

Рисунок 2 БПФ Recordings. БПФ был рассчитан для 30 мс часть каждой развертки, где шум функции должен быть вставлен (площадь, ограниченная красными окно на рисунках 1А, 1Б). Цифры 2А и 2В показывают БПФ рассчитан без учета и с шумом функции, соответственно. Еще раз, для ясности, только БПФ от каждого пятого развертки включается в цифру, но все это проносится были использованы в будущих расчетах.

На рис. 3 IV Частота корреляции: результаты корреляции между кривой IV от записи и амплитуды отдельных частот в диапазоне ступеней напряжения показана. Цифры 1А - 1C показывают коэффициент корреляции для частот от 0 до 20 кГц под контролем условиях и в присутствии 50 или 100 мВ функций шума, соответственно.

Рисунок 4 воссоздание Кривая IV:. Кривая IV для модели клетки (так же как показано на рисунке 1C) и величины двух частотах были наложены. Первая частота была постоянная составляющая (R = 0,995), а второй был случайно выбранных частот с низкой корреляции (R = 0,3212). Частота амплитуды были сокращены примерно одинаковую амплитуду, как кривая IV.

Обсуждение

Есть технические препятствия, которые в настоящее время предотвратить исследователей из измерения различных типов ионных каналов одновременно с намерением последующего определения того, сколько тока должны быть отнесены к каждому каналу типа. Из-за этого ограничения, ионные каналы обычно изучаются по отдельности, используя методы, такие как напряжение, ток, и потенциал действия зажима. ¹ Для изучения отдельных типов каналов, гетерологичных выражение системы часто используются. ² При работе с клетки, выделенные из тканей, таких как кардиомиоциты , другие средства должны быть использованы для блокирования различных ионных каналов. Например, натриевые каналы могут быть инактивируется медленным деполяризующего напряжения рампы, ³ внутрь исправления калиевых каналов может быть заблокирован с внеклеточной BaCl2, ⁴ и кальциевые каналы могут блокироваться по верапамил ^5.

Один метод, который частично преодолевает это ограничение для измерения тока потока по двум каналам одновременно типов, а затем повторите измерение после выборочной блокировки один канал типа с помощью соответствующего средства. Вычитание двух измерений могут быть использованы для оценки количества тока связано с каналом типа, который был заблокирован. ⁶ Тем не менее, Есть два основных ограничения для этой техники. Во-первых, химические вещества не были выявлены, которая может выборочно блокировать друг ионного канала, и некоторые широко используемые препараты неспецифического взаимодействия с другими типами каналов. ^5,7 Во-вторых, она не может быть определена по этой технике ли один канал модулируется другим канала. Например, гетерогенный выражение NaV 1,5 и 2,1 Кир был показан в желудочки морских свиней, и было высказано предположение, что синергетический связь существует между двумя каналами, например, что более высокие Кир 2,1 выражение в правый желудочек угнетает проводимость скорости. ⁸ настоящее , это не может быть проверена.

В этом исследовании мы предполагаем, что импедансной спектроскопии может быть полезным инструментом для изучения нескольких типов ионных каналов измеряются одновременно. Хотя метод, представленный никогда не была использована, чтобы выделять течения из двух типов каналов измеряются одновременно, импедансной спектроскопии был использован для исследования и ряд других аспектов функции ионного канала. Гудман и искусства показали использовании черепахи слуховые волосковые клетки, что нынешние протоколы зажим может быть изменен, чтобы настроить ячейку на разные частоты, и колебания в трансмембранного потенциала связано с взаимодействием между внутренним исправления K ⁺ каналов и Са ^{2 +} канал. ⁹ Хана и Фрейзер показали, что сопротивление может быть измерена в одной ячейке в широком диапазоне частот (100 Гц до 5 МГц), а также увеличение сопротивления наблюдается при K ⁺ или Са ^{2 +} каналы были заблокированы, могут быть простыми средствами обнаружить канал блока в высоких экраны наркотиков пропускную ^10. Хаяси и Фишман использовали комплексной проводимости для изучения кинетических свойств внутреннего исправления K ⁺ канала. ¹¹ Другие группы вставили одной частоты в напряжение протокол зажим различных типов каналов и показали, что наблюдается частотная согласился с ожидаемой реакции на некоторые частоты, но не другие. ^12,13 Millonas и Hanck предложил причине некоторые частоты не дали ожидаемую реакцию, является наличие нескольких констант скоростей в модели Маркова. ¹² Исследования, такие как эти, а также другие, показали, что Есть случаи, когда ионные токи измеряется от ионных каналов при использовании импедансной спектроскопии не согласны с теоретической АЧХ. Это не имеет значения в данном исследовании, потому что цель метода в данном исследовании является определение частот, которые коррелируют с амплитудой тока зависят от исходных предположений мембраны электрической цепи. Furtheremore, амплитуда тока рассчитывается по части записи, которые не имеют никакого шума функции вставляются в них. Ряд других исследований также существующие модели многочисленных ионных каналов выставке многочисленных государств проводить и без проведения всех со своими константами скорости. ^14,15,16 Томпсон и др. показали, что селективность фильтра канала КГГА имеет разные сайты связывания Na ^+, Li + и K ^+, и энергичная расходов на переезд из одного связывающего участка к другому, как ион проходит через избирательность фильтра является то, что делает канал преимущественно поведения ионов К ⁺ через ее поры. ¹⁷ В данной работе мы вставили диапазоне частот (шум функции) в напряжение протокол шаг и посмотрел на частоты, амплитуда которых сильно коррелируют с общей амплитудой тока. Так как сильное доказательство было представлено предлагая несколько констант скоростей играть роль в проводимости ионов через дифференциальноет каналов, внедрение частот, связанных с этими константами скорости может вызвать определенные частоты в резонанс или в значительной степени коррелирует с амплитудой тока, которые не имели бы. Техника показала в этом исследовании проводится на клеточную модель, которая является параллельной RC-цепь, которая обычно используется для проверки напряжения схемы зажим и приобретение оборудования. Не ожидается, что любой, кроме частот DC будет коррелировать с текущей величины, и это показано в наших данных. Также показано, что добавление шума функция не вызывает никаких частот высоко коррелирует с амплитудой тока. Эти два выводы имеют важное значение, потому что они показывают, что измерительное оборудование и шума функции сами по себе не вызывает никаких частот коррелирует с амплитудой тока. При дальнейших исследованиях производить измерения с использованием мембран содержащих ионные каналы, ожидается, что в зависимости от используемого канала, частоты, соответствующие константы скорости в фильтре избирательность или, возможно, пора будет влиять на частотную характеристику канала и повлиять на какие частоты имеют высокую или низкой корреляции с амплитудой тока.

Поскольку этот метод является новой техники для изучения ионных каналов, Есть ряд направлений будущих исследований могли бы следовать. Во-первых, техника должна быть использована для характеристики частотной характеристики конкретных изолированных каналов. Дополнительная работа также должна быть сделана для калибровки частоты амплитуды к текущей амплитуды. После нескольких каналов характеризуются индивидуально, несколько типов канал должен быть измерены одновременно. Метод может быть также адаптирован для использования в потенциал действия зажим, токовые клещи, и полевые исследования стимуляции. Хотя это и новая техника, это показывает, что может быть мощным способом сделать электрофизиологических измерений, которые ранее были невозможны и дать ценную-новому взглянуть на физиологической роли ионных каналов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Matlab	Mathworks	н/д	Натик, Массачусетс
Clampex 8	Molecular Devices	Clampex 8	Саннивейл, Калифорния
Интегрирующий усилитель для локального прижимного зажима	Molecular Devices	Axopatch 200	Саннивейл, Калифорния
Головной блок (Headstage)	Molecular Devices	CV202	Саннивейл, Калифорния
16-битная система сбора данных	Molecular Devices	Digidata 1322A	Саннивейл, Калифорния
Модельная клетка	Molecular Devices	Patch 1 Model Cell	Саннивейл, Калифорния