Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.
- Хирургическая процедура
ПРИМЕЧАНИЕ: Хроническая канюляция cisterna magna (CM) позволяет животным восстановиться после хирургической процедуры. Инъекции КМ делаются на следующий день после имплантации канюли и, что важно, могут быть выполнены как у животных под наркозом, так и у бодрствующих животных. Поскольку это восстановительная операция, процедуры должны проводиться в стерильных условиях. - Взвесьте мышь (C57BL/6JRj, оба пола, 8 недель) и обезболите ее смесью кетамина и ксилазина (100 мг/кг; 10 мг/кг, соответственно) с помощью внутрибрюшинной инъекции (внутривенно). При необходимости во время хирургического вмешательства необходимо повторно ввести мышке половинную дозу кетамина (50 мг/кг). В качестве альтернативы, при хронической канюляции, обезболите мышь, поместив ее в индукционную камеру изофлурана с концентрацией 2,5 - 3% изофлурана при концентрации кислорода (O2) примерно 1 л/мин. В этом случае используйте носовой конус для поддержания изофлурановой анестезии на уровне 1,5 - 2% на протяжении всей операции.
- Когда рефлексы защемления пальцев ног прекращаются и дыхание становится медленным и устойчивым, поместите животное в стереотаксическую рамку поверх грелки.
- Применяют офтальмологическую мазь. При необходимости повторяйте во время операции.
- Побрейте голову и шею мыши, удалите шерсть и простерилизуйте открытые участки кожи сначала спиртовым тампоном, а затем два раза хлоргексидином (0,5%) или раствором йода (2%). Повторите стерилизацию еще два раза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Смените хирургическую простыню, чтобы удалить мусор и волосы после бритья. Затем накиньте животное на защиту, чтобы защитить стерильное поле. - При хронической канюляции введите 0,5 - 1 мл лидокаина/бупивакаина (1 мг/мл и 0,25 мг/мл соответственно) подкожно (подкожно) в место разреза. Назначают бупренорфин (0,05 мг/кг; сук) для послеоперационной анальгезии.
- Закрепите мышь в стереотаксической рамке. После обеспечения фиксации, либо внутриушной, либо с помощью скуловой дуги, слегка наклоните голову так, чтобы она образовала угол 120° к телу (рис. 1E).
- Найдите часть черепа, выступающую непосредственно над мышцами шеи – затылочный гребень. Поднимите вышележащую кожу с помощью пинцета и отрежьте миндалевидный кусок кожи примерно 1 см по средней линии. Используйте ватные палочки или копья для глаз, чтобы остановить любое возникающее кровотечение.
- Используя затылочный гребень в качестве точки отсчета, раздвиньте поверхностную соединительную ткань, чтобы обнажить мышцы шеи ниже.
- Разделите мышцы по средней линии, осторожно проведя щипцами вниз по середине места разреза по передней и задней оси. С парой изогнутых щипцов в каждой руке соедините кончики посередине в нижней части черепа и отведите мышцы в сторону.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно обнажить КМ, который выглядит как крошечный перевернутый треугольник, очерченный мозжечком вверху и мозговым веществом внизу, позади полупрозрачной дуральной мембраны (Рисунки 1B и 1C). - С помощью хирургического глазного копья или ватного тампона протрите твердую мозговую оболочку, покрывающую КМ.
- Вставьте канюлю в CM
- Извлеките канюлю из шприца, наполненного искусственной спинномозговой жидкостью (aCSF), удерживая иглу 30G прикрепленной к заднему концу трубки.
- Присоедините иглу 30G к дистиллированному водяному шприцу объемом 100 мкл, подключенному к шприцевому насосу.
- Введите в канюлю пузырь воздуха размером около 1 см, оттягивая воздух с помощью шприцевого насоса.
- С помощью шприцевого насоса введите в канюлю 12 мкл нужного индикатора спинномозговой жидкости (СМЖ).
- Возьмитесь за канюлю, заполненную индикатором спинномозговой жидкости, рядом с иглой, покрытой трубкой, с помощью пары изогнутых пинцетов, которые вы держите в доминирующей руке. Положите средний палец недоминантной руки на ушную планку противоположной стороны и удерживайте ее неподвижно для последующего использования в качестве подставки для канюли.
- Вставьте канюлю под углом 45° относительно головки мыши, проходя в центр КМ, определяемый его треугольной стороной, видимой через твердую мозговую оболочку. Избегайте любого проникновения мозжечка или мозгового вещества. Убедитесь, что игла вставлена только на глубину 1–2 мм, например, до точки, где скос полностью находится под твердой мозговой оболочкой. Отпустите пинцет, удерживающий канюлю, и пусть канюля опирается на недоминирующую руку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Скошенный конец стоматологических игл потребует приложения некоторого усилия для прокалывания твердой мозговой оболочки, покрывающей КМ. - При необходимости высушите любую утечку спинномозговой жидкости при проникновении с помощью хирургического глазного копья или ватных тампонов.
- Нанесите 2-3 капли цианоакрилатного клея на дуральную мембрану, окружающую канюлю. Добавьте каплю ускорителя клея, чтобы клей сразу же застыл. Покройте череп и иглу смесью стоматологического цемента (примерно 0,5 мг) и цианоакрилатного клея (3 – 5 капель). Сразу после этого нанесите каплю клеевого ускорителя для отверждения.
