Инъекция флуоресцентных нейронных клеток-предшественников в органоиды головного мозга человека для моделирования трансплантации

Аннотация

Источник: Ibanez-Rios, M.I., et al., A Human Cerebral Organoid model of Neural Cell Transplantation. J. Vis. Exp. (2023)

В этом видео демонстрируется инъекция флуоресцентно меченых нейронных клеток-предшественников (NPC) в органоиды головного мозга человека с помощью клеточно-матричной смеси. Метод воспроизводим и не требует использования животных, что позволяет проводить трансплантацию с минимальным разрушением органоидов. Он предлагает ценную платформу для моделирования нейротрансплантатов и заболеваний центральной нервной системы (ЦНС).

Протокол

Все процедуры по сбору проб были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.

1. Инъекция меченых клеток в органоид мозга

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой работы церебральные органоиды были изготовлены с использованием коммерческого набора в соответствии с инструкциями производителя. Его можно заменить на представляющий интерес церебральный органоид. Материалы, используемые в этой части протокола, должны быть предварительно охлаждены, чтобы избежать гелеобразования солюбилизированной матрицы базальной мембраны при температурах выше 4 °C.

1. Поместите инсулиновые шприцы, наконечники и трубки, которые будут контактировать с матрицей солюбилизированной базальной мембраны, при температуре −20 °C, чтобы дать им остыть.
2. Разморозьте соответствующую по размеру аликвоту солюбилизированной матрицы базальной мембраны на льду, в зависимости от количества инъекций, которые будут выполнены (~2 μл/впрыск). Это занимает примерно 30 минут.
3. Пока аликвота оттаивает, разделите, соберите и подсчитайте клетки.
4. Рассчитайте объемы, необходимые для одного впрыска. При проведении нескольких инъекций поместите общий объем клеток в пробирку объемом 1,5 мл и добавьте до 1 мл DMEM/F12.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для учета потерь/ошибок пипетирования следует использовать объем, который позволяет сделать несколько дополнительных инъекций.
5. Поместите клетки в лед, пока готовятся следующие шаги.
6. После размораживания разбавьте растворенную матрицу базальной мембраны до конечной концентрации 3 мг/мл в ледяном DMEM/F12.
7. Возьмите одноклеточную суспензию изо льда и вращайте ее при температуре 300 × г в течение 5 минут при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если охлаждаемая центрифуга недоступна, обычно допускается вращение при комнатной температуре.
8. Аккуратно удалите среду полностью, не потревожив клеточную гранулу. Ресуспендируйте клеточную гранулу путем щадящего пипетирования в разбавленной солюбилизированной матрице базальной мембраны (3 мг/мл) до получения конечного объема 2 мкл на каждую выполняемую инъекцию и немедленно поместите ее обратно на лед до использования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ресуспендию клеток необходимо проводить медленно и с предварительно охлажденными наконечниками, чтобы избежать образования пузырьков и гелеобразования.
9. Переложите предварительно охлажденные шприцы из морозильной камеры при температуре −20 °C в ведро со льдом. Храните их там до использования.
10. Достаньте тарелку с органоидами мозга из инкубатора. Используйте наконечник с широким отверстием для переноса органоида для введения в чашку диаметром 35 мм. Удалите всю возможную среду, не повреждая органоид, чтобы стабилизировать его и облегчить инъекцию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать наконечники с широким отверстием, чтобы избежать разрушения органоида. Если их нет, отрежьте конец обычного наконечника в 1000 песо стерильными ножницами.
11. Поместите 35-миллиметровую чашку, содержащую органоид, под препарирующий микроскоп, чтобы помочь направить и облегчить инъекцию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если в стерильной зоне нет микроскопа для препарирования, можно выполнить инъекцию без него, хотя и с несколько меньшим контролем. Еще одной альтернативой является использование петли увеличения или очков.
12. Как только органоид (органы) будет готов к введению, осторожно ресуспендируйте клетки с помощью охлажденного наконечника пипетки P20 и переместите 2 мкл (содержащие желаемое количество клеток для инъекции) на предварительно охлажденное стерильное предметное стекло.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для многократных инъекций можно добавить еще 2 мкл объема через предметное стекло. Держите его на льду, и следите за тем, чтобы избежать испарения.
13. Возьмите предварительно охлажденный инсулиновый шприц со льда и медленно наберите 2 мкл клеточной суспензии скосом иглы вниз, чтобы все клетки/среда могли впитаться.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что вы двигаетесь очень медленно, чтобы избежать втягивания воздуха.
14. Откройте крышку чашки, содержащей органоид, и наведите на нее микроскоп. Держите блюдо одной рукой. Поместите скос иглы вверх, а другой рукой медленно вводите клетки в поверхность органоида.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно вводить медленно, чтобы не повредить ткань.
15. После инъекции поместите крышку обратно в чашку и дайте введенному органоиду постоять 1-2 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволяет разбавленной, солюбилизированной матрице базальной мембраны гелеобразно образоваться, удерживая клетки на месте. Если среду добавить слишком рано, она может смыть клетки, сидящие на поверхности.
16. Аккуратно добавьте 500 μL органоидной среды и переложите органоид с широким наконечником в лунку 24-луночного планшета. Инкубируйте органоид при 37 °C и 5%_CO2 в течение ночи. Выполняйте полную замену среды каждый второй день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно включить органоид отрицательного контроля (имитационный), который будет использоваться для корректировки визуализации. Для этого вводят органоид, как описано ранее, с разбавленной солюбилизированной матрицей базальной мембраны (3 мг/мл) для получения конечного объема 2 мкл без клеток.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
DMEM F12/Glutamax	Thermo	10565018
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR)	Corning	356231	Phenol Red-free, LDEV-free