Фоторазлагаемая изоляция колоний бактерий на основе гидрогеля в массивах микролунок

Аннотация

Источник: Fattahi, N., et al. Фоторазлагаемые гидрогелевые интерфейсы для скрининга, отбора и изоляции бактерий. J. Vis. Exp. (2021)

В этом видео демонстрируется использование фоторазлагаемых гидрогелей для выделения колоний бактерий в кремниевых микролуночных массивах. Бактериальные клетки сначала загружаются в микролунки, инкапсулируются в сшитый гидрогель и культивируются в отдельные колонии. При воздействии ультрафиолетового излучения целенаправленное разложение гидрогеля позволяет селективно экстракционировать отдельные колонии.

Протокол

1. Штаммы бактерий и протоколы культивирования

1. Просейте колонии бактерий на агаровых планшетах, дополненных соответствующими питательными средами. В данном отчете Bacillus subtilis (штамм 1A1135, Bacillus Genetic Stock Center) культивируется на ATGN (0,079 M KH₂PO₄, 0,015 M (NH₄)₂SO₄, 0,6 мМ MgSO₄·7H₂O, 0,06 мМ CaCl₂·2H₂O, 0,0071 mM MnSO₄·H₂O, 0,125 M FeSO_4·7H₂O, 28 мМ глюкозы, pH: 7 ± 0,2, 15 г/л агара) агаровые пластины с добавлением 100 мкг/мл спектиномицина и Escherichia coli (штамм 25922, ATCC) на агаровых пластинах ATGN с добавлением 100 мкг/мл ампициллина.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В предыдущих сообщениях об инкапсуляции гидрогеля и высвобождении этих материалов вместо этого использовались клетки A. tumefaciens C58
2. Выберите желаемые колонии из агаровых пластин ATGN и начните культивирование в течение ночи. Используемые здесь штаммы E. coli и B. subtilis культивируют при температуре 37 °C и встряхивают при 215 об/мин в жидкой среде ATGN в течение 24 ч. Храните клеточные культуры в 50% глицерине при температуре -80 °C до дальнейшего использования.
3. Отоберите колонии обоих штаммов из запасов глицерина с помощью стерильных контуров инокуляции и инкубируйте в жидких средах ATGN в течение 24 ч при 37 °C и 215 об/мин.

2. Получение материала, необходимого для получения гидрогеля

1. Фоторазлагаемый синтез поли(этиленгликоля)-о-нитробензилдиакрилата (PEG-o-NB-диакрилата)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Собственный синтез PEG-o-NB-диакрилата был хорошо описан и ранее описан. В качестве альтернативы, поскольку синтез является рутинным, он может быть передан на аутсорсинг из предприятия химического синтеза.
2. Перекрестная сшивка buffer
   1. Возьмите рецепт выбранной среды для штамма бактерий и приготовьте среду с 2x питательными веществами. Добавьте фосфат, например,₂PO_4, в среду до конечной концентрации 100 мМ. Затем отрегулируйте значение pH до 8 с помощью 5 М NaOH (aq).
   2. Стерилизуйте буферный раствор и храните его при температуре -20 °C до дальнейшего использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Исключите все переходные металлы, присутствующие в среде, так как эти металлы катализируют окисление тиолов до дисульфидов.
3. PEG-o-NB-diacrylate solution
   1. Для каждого мг аликвотного порошка PEG-o-NB-диакрилата (молекулярная масса 3,400 Да) добавьте 3,08 μL сверхчистой воды, чтобы достичь концентрации PEG-o-NB-диакрилата 49 мМ (концентрация акрилата 98 мМ).
   2. Перемешайте раствор до тех пор, пока он хорошо не перемешается, и храните этот раствор при температуре -20 °C до дальнейшего использования.
4. 4-arm PEG-thiol solution
   1. Для 4-плечевого препарата PEG-тиола (молекулярная масса 10 000 Да) добавьте 4 мкл сверхчистой воды на мг порошка, чтобы достичь концентрации 20 мМ (80 мМ концентрации тиола).
   2. Ввергните этот раствор в вихрь до тех пор, пока он хорошо не перемешается, и храните этот раствор при температуре -20 °C до дальнейшего использования.

5. Изготовление кремниевых микролуночных массивов

1. с париленовым покрытием: Используйте стандартный протокол, описанный в предыдущих исследовательских статьях, для покрытия кремниевых пластин париленом.
2. Микропроизводство: Следуйте протоколу, описанному в литературе, для проектирования и изготовления массива микролунок (Рисунок 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартные фотолитографические методы были применены для изготовления массивов микролунок на кремниевых пластинах, покрытых париленом.

7. Образование гидрогеля на микролуночных массивах

1. Посев бактерий в микролуночных массивах
   ПРИМЕЧАНИЕ: 700 мкл 0,1 OD₆₀₀ (оптическая плотность на длине волны 600 нм) клеточных суспензий были засеяны на подложки микролуночного массива, и для удаления клеток из фона был применен метод отрыва парилена.
2. Приготовьте раствор гидрогелевого предшественника, добавив 5,6 мкл PEG-o-NB-диакрилата с 12,5 мкл фосфатно-солевого буфера ATGN с pH 8 и смешав с 6,9 мкл четырехплечевого раствора тиола PEG.
3. Пипетку 12,5 мкл раствора прекурсора нанесите на нереакционноспособное перфторалкилированное стеклянное стекло и поместите две стальные прокладки длиной 38 мкм (см. Таблицу материалов) на две противоположные стороны подложки микролуночного массива, инокулированного клетками.
4. Переверните предметное стекло с помощью перфторалкилированного стекла с каплей раствора прекурсора и поместите каплю в середину подложки микролунки. Затем инкубируйте в течение 25 минут при комнатной температуре (RT) для образования гидрогеля.
5. Аккуратно снимите предметное стекло с подложки микролунки. Гидрогелевая мембрана должна оставаться прикрепленной к субстрату микролунки.

Результаты

Рисунок 1: Проектирование и изготовление массивов микролунок. (A) Стандартные методы микропроизводства были применены для изготовления массивов микролунок на Кремниевые пластины. (B) Каждый субстрат состоял ...

Материалы