Разделение внутренней и наружной мембранных фракций грамотрицательных бактерий

Аннотация

Источник: Cian, M. B. et al., Разделение клеточной оболочки для грамотрицательных бактерий на внутреннюю и внешнюю мембранные фракции с техническими корректировками для Acinetobacter baumannii. J. Vis. Exp. (2020)

В этом видео показано разделение внутренней и внешней мембранных фракций грамотрицательных бактерий с помощью ультрацентрифугирования градиента сахарозы. Мембранные фракции очищаются и хранятся при низких температурах для целенаправленного анализа мембраноспецифических компонентов.

Протокол

1. Общие реагенты и подготовка среды для мембранной экстракции

1. Бактериальные среды для выращивания: Приготовьте и простерилизуйте 1 л бульонной среды в тщательно очищенной и автоклавированной колбе объемом 2 л.
2. Общий ресуспензионный буфер (1 М трис(гидроксиметил)аминометановый буфер (Tris Buffer) pH 7,5; 50 мл): Растворите 6,05 г основания Tris в 30 мл H₂O. Отрегулируйте pH до 7,5 с помощью 5 M HCl. Отрегулируйте конечный объем до 50 мл с помощью сверхчистого H₂O.
3. Основной запас раствора хелирования двухвалентных катионов (0,5 М этилендиамина тетрауксусной кислоты, ЭДТА pH 8; 100 мл): Добавьте 18,6 г динатрия этилентетраацетата·2H₂O к 80 мл H₂O. Энергично перемешайте и отрегулируйте pH до 8,0 с помощью гидроксида натрия (NaOH). Отрегулируйте окончательный объем до 100 мл с помощью сверхчистого H₂O.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Динатриевая соль ЭДТА не растворится до тех пор, пока pH раствора не будет скорректирован до ~8,0 путем добавления NaOH.
4. Осмотический буфер А (0,5 М сахарозы, 10 мМ Трис pH 7,5; 1 л): Взвесьте 171,15 г сахарозы и перелейте ее в цилиндр объемом 1 л. Добавьте 10 мл 1 М Трис pH 7,5. Отрегулируйте конечный объем до 1 л с помощью сверхчистого H₂O. Хранить при температуре 4 °C.
5. Лизоцим (10 мг/мл; 5 мл): Смассируйте 50 мг лизоцима (куриного яичного белка) и растворите в 5 мл ультрачистого H₂O. Хранить при температуре 4 °C.
6. Разбавленный раствор хелирования двухвалентных катионов (1,5 мМ ЭДТА; 500 мл): Добавьте 1,5 мл 0,5 М ЭДТА (Шаг 1.3) в 497,5 мл сверхчистого Н₂О. Хранить при 4 °С.
7. Осмотический буфер B (0,2 М сахарозы, 10 мМ Tris pH 7,5; 2 л): Взвесьте 136,8 г сахарозы и перелейте ее в цилиндр объемом 2 л. Добавьте 20 мл 1 М Трис pH 7,5. Отрегулируйте конечный объем до 2 л с помощью сверхчистого H₂O. Хранить при температуре 4 °C.
8. Нуклеазный кофактор (1 М хлорида магния, MgCl₂; 10 мл): Растворите 2,03 г MgCl₂·6H₂O в 8 мл ультрачистого H₂O. Отрегулируйте объем до 10 мл. Хранить при комнатной температуре.
9. Коктейль нуклеазных растворов, включающий ферменты РНКазу и ДНКазу: см. Таблицу материалов. Хранить при температуре -20 °C.
10. Коктейль ингибиторов протеазы: см. Таблицу материалов. Хранить при температуре 4 °C.
11. Изопикнный градиентный раствор сахарозы низкой плотности (20% мас.% сахарозы, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ раствор Tris pH 7.5; 100 мл): Взвесьте 20 г сахарозы и переложите в цилиндр объемом 200 мл. Добавьте 100 мкл 1 М Трис Буфера pH 7,5 и 200 мкл 0,5 М ЭДТА pH 8. Отрегулируйте окончательный объем до 100 мл с помощью сверхчистого H₂O. Хранить при комнатной температуре.
12. Изопикнический градиентный раствор сахарозы средней плотности (53% по массовому объему сахарозы, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ раствор Tris pH 7,5; 100 мл): Взвесьте 53 г сахарозы и переложите в градуированный цилиндр объемом 200 мл. Добавьте 100 мкл 1 М Трис Буфера pH 7,5 и 200 мкл 0,5 М ЭДТА pH 8. Отрегулируйте конечный объем до 100 мл с помощью сверхчистого H₂O. Хранить при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте этот раствор в градуированном цилиндре для обеспечения точности благодаря высокому проценту сахарозы. Добавьте магнитную мешалку и перемешивайте до полного растворения сахарозы в растворе. Этот процесс может занять несколько часов.
13. Изопикнический градиентный раствор сахарозы высокой плотности (73% по массовому объему сахарозы, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ раствор Tris pH 7,5; 100 мл): Взвесьте 73 г сахарозы и переложите в градуированный цилиндр объемом 200 мл. Добавьте 100 мкл 1 М Трис Буфера pH 7,5 и 200 мкл 0,5 М ЭДТА pH 8. Отрегулируйте конечный объем до 100 мл с помощью сверхчистого H₂O. Хранить при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте этот раствор в градуированном цилиндре для обеспечения точности благодаря высокому проценту сахарозы. Добавьте магнитную мешалку и перемешивайте до полного растворения сахарозы. Этот процесс может занять несколько часов.
14. Буфер для хранения с изолированной мембраной (10 мМ Tris Buffer pH 7,5; 1 л): Добавьте 1 мл 1 M Tris Buffer pH 7,5 в колбу объемом 1 л и отрегулируйте окончательный объем до 1 л с помощью сверхчистого H₂O.

2. Подготовка бактерий к мембранной экстракции

:

1. Переложите бактерии из замороженных запасов глицерина на свежие агаровые пластины. Храните пластины при температуре 4 °C, как только разовьются колонии. Введите одну колонию в пробирку объемом 5 мл, заполненную бульонной средой, и культивируйте бактерии по желанию в течение ночи.
2. Разбавьте ночную бактериальную культуру в 1 л предпочтительной бульонной среды и культивируйте бактерии до достижения желаемой оптической плотности.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инокуляция одной бактериальной колонии в 1 л бульонной среды рекомендуется для мутантных генотипов, которые склонны к подавлению фенотипов роста, но некоторые грамотрицательные бактерии просто растут медленнее, чем другие. Если невозможно достичь достаточной плотности культуры путем инокуляции одной колонией, одним из стратегий синхронизации роста является обратное разбавление культуры за ночь до 1 л среды. Бактериально-мембранный состав варьируется в зависимости от фазы роста культуры (логарифмическая или стационарная фаза). Кривые роста, измеряющие изменение оптической плотности бактериальных культур в зависимости от времени, должны быть выполнены для всех штаммов, чтобы коррелировать плотность культуры с фазой роста.
3. Поставьте колбы с бульонными культурами на лед. Считайте оптическую плотность на длине волны 600 нм (наружный диаметр₆₀₀) и рассчитайте объем культуры, эквивалентный от 6,0 до 8,0 x 10¹¹ бактериальных колониеобразующих единиц (КОЕ). Для S. Typhimurium это соответствует 1 л культуры при наружном диаметре₆₀₀ от 0,6 до 0,8, поскольку внешний диаметр 600 равен примерно 1,0x10⁹ КОЕ/мл. Добавьте этот объем в центрифужную пробирку и убедитесь, что оставшиеся культуры остаются на льду до тех пор, пока их нельзя будет использовать.
4. Гранулируйте бактерии центрифугированием при 4 °C при 7 000-10 000 x g в высокоскоростной центрифуге с фиксированным углом наклона в течение 10 мин.<бр />ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно охладите и поддерживайте центрифуги при низкой температуре. Держите образцы на льду в течение всей процедуры.
5. Осторожно сцедите надосадочную жидкость и выбросьте надосадочную жидкость.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если мембранные фракции не будут экстрагироваться немедленно, гранулы можно мгновенно заморозить и/или хранить при температуре -80 °C. Тем не менее, рекомендуется приступать непосредственно к плазмолизу в тот же день, когда были собраны клетки, особенно для неэнтеробактериальных видов.

3. Диссоциация внешней мембраны и плазмолиз

1. Разморозьте клеточные гранулы на льду, если они ранее хранились при температуре -80 °C, и сохраните образцы на льду до конца процедуры. Повторно суспендируйте каждую клеточную гранулу в центрифужной пробирке в 12,5 мл буфера А. Добавьте магнитную мешалку к суспензии клеток.
2. Добавьте 180 мкл 10 мг/мл лизоцима (конечная концентрация 144 мкг/мл) в каждую клеточную ресуспензию. Держите образцы на льду при помешивании в течение 2 минут.
3. Добавьте 12,5 мл 1,5 мл раствора ЭДТА в каждую ресуспендию клеток и продолжайте перемешивать на льду еще 7 минут.
4. Сцедите суспензию в коническую пробирку объемом 50 мл и центрифугируйте при давлении 9 000-11 000 x g в течение 10 минут при 4 °C.
5. Выбросьте надосадочную жидкость в контейнер для биологически опасных отходов и оставьте гранулы на льду.
6. Добавьте в клеточную гранулу 25 мл буфера В.
7. Добавьте 55 мкл 1 М MgCl₂, 1 мкл реагента нуклеазы РНКазы/ДНКазы (чтобы избежать проблем с вязкостью, связанных с бактериями, подвергающимися плазмолизу перед гомогенизацией) и 1 мкл коктейля ингибиторов протеазы в объем буфера В, который находится поверх клеточной гранулы
8. . Энергично пипетка и вихрь до тех пор, пока не будет получен однородный раствор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно иметь однородный раствор, прежде чем переходить к этапу 4 этого протокола. Ресуспендированные клетки должны иметь вязкий вид и консистенцию, похожую на тесто для торта.
9. Сделайте вихревой обработкой каждый образец в течение 15 с. Удерживайте взвеси на льду и приступайте к шагу 4.

4. Гомогенизация под давлением и лизис
ПРИМЕЧАНИЕ: Для лизиса можно использовать несколько методов. Ультразвук не идеален из-за выделения тепла. Осмотический лизис может быть достигнут, но часто неэффективен. Поэтому мы рекомендуем лизис под высоким давлением. Лизис под высоким давлением может быть достигнут с помощью различных инструментов. Мы предлагаем гомогенизирующие машины, такие как френч-пресс или Emusliflex. Мы работаем со многими типами грамотрицательных бактерий, реакция которых на растворы сахарозы с высоким содержанием осмолярной сахарозы различается. Этап гомогенизации под высоким давлением повышает эффективность, воспроизводимость и выход продукции.

1. Предварительно охладите ячейку френч-пресса при 4 °C или вставьте металлическую катушку из гомогенизатора на лед.
2. Залейте образец в ячейку французского давления или цилиндр с гомогенизатором и доведите ячейку до желаемого давления гомогенизации (10 000 фунтов на квадратный дюйм должно быть достаточно при использовании френч-пресса или 20 000 фунтов на квадратный дюйм при использовании гомогенизатора).
3. Отрегулируйте скорость потока на выходе примерно до одной капли в секунду, сохраняя при этом давление при использовании френч-пресса.
4. Соберите лизат клеток в конические пробирки объемом 50 мл, держа образцы на льду.
5. Повторите шаги 4.2-4.4 от трех до пяти раз, чтобы достичь полного лизиса, на который обычно указывает постепенное повышение прозрачности образца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Камера для образцов должна быть промыта и уравновешена буфером B между образцами.
6. Храните лизированные клетки на льду.

5. Полное мембранное фракционирование

1. Центрифугируйте лизированные образцы бактерий при 6,169 x g в течение 10 минут при 4 °C для гранулирования оставшегося неповрежденного клеточного материала. (например, нелизированные бактериальные клетки).
2. Распределите оставшуюся порцию надосадочной жидкости, которая теперь содержит гомогенизированные мембраны, в поликарбонатную бутылку для ультрацентрифугирования.
   ВНИМАНИЕ: При необходимости образцы клеток можно сбалансировать, разбавив буфером B.
3. Ультрацентрифугирование клеточных лизатов при 184 500 x g в течение не менее 1 ч при 4 °C. Этот шаг может быть выполнен в течение ночи без ущерба для качества мембран.
4. Выбросьте оставшуюся надосадочную жидкость, присутствующую в ультрацентрифужной пробирке, и сохраните мембранные гранулы на льду (Рисунок 1).
5. Ресуспендируйте мембранные гранулы в 1 мл градиентного раствора изопикно-сахарозы низкой плотности с помощью гомогенизатора glass-Dounce. Перенесите образец гомогената в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл с помощью стеклянной пипетки Пастера и задержите на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется только анализ полного состава мембраны, замените 1 мл изолированного мембранного градиентного раствора низкой плотности изопикнико-сахарозным градиентом на 1 мл изолированного мембранного буфера для хранения. Шаг 5.5 является конечной точкой выделения, если требуется только общее количество образцов бактериальной мембраны. Храните образцы при температуре -20 °C до тех пор, пока не потребуется дальнейший анализ.

6. Ультрацентрифугирование с градиентом плотности для разделения двойных мембран

1. Соберите соответствующее количество полипропиленовых или ультрапрозрачных пробирок объемом 13 мл с открытым верхом, указанных для качающегося ротора ковша и ультрацентрифуги.
2. Держите пробирку в слегка наклоненном положении и приготовьте градиент сахарозы, медленно добавляя растворы сахарозы от более высокой плотности к более низкой плотности в следующем порядке:2 мл 73% массы сахарозы,1 мМ ЭДТА, 1 мМ Трис pH 7,54 мл 53% массы сахарозы, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ Трис pH 7,5
   1. Далее, добавить общую мембранную фракцию (1 мл), которая была ресуспендирована в 20% массовом растворе сахарозы (шаг 5.5). Избегайте смешивания мембранной фракции с раствором сахарозы, который находится под ней. Между каждым из этих слоев должны быть видны разделения.
   2. Наконец, заполните пробирку раствором изопикно-сахарозного градиента низкой плотности (около 6 мл). Полипропиленовые и сверхпрозрачные пробирки с открытым верхом должны быть заполнены как можно полнее (на расстоянии 2 или 3 мм от верхней части трубки) для поддержки трубки.
3. Адаптация для Acinetobacter baumannii 17978
   1. Адаптируйте скорректированный градиент сахарозы для использования с различными образцами бактерий. Для A. baumannii следующий градиент сахарозы обеспечивал более полное разделение мембран (рис. 2).2 мл 73% массы сахарозы, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ Трис pH 7,54 мл 45% сахарозы, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ Трис pH 7,5
   2. Затем добавьте общую мембранную фракцию (1 мл), которая была ресуспендирована в 20% массовом растворе сахарозы (шаг 5.5). Избегайте смешивания мембранной фракции с раствором сахарозы, который находится под ней. Между каждым из этих слоев должны быть видны разделения.
   3. Наконец, заполните пробирку дисопично-сахарозным градиентным раствором низкой плотности (около 6 мл). Полипропиленовые и сверхпрозрачные пробирки с открытым верхом должны быть заполнены как можно полнее (на расстоянии 2 или 3 мм от верхней части трубки) для поддержки трубки.
4. Ультрацентрифугирование образцов с помощью ротора с качающимся ковшом при температуре 288 000 x g и 4 °C в течение ночи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для объемов, использованных на предыдущих этапах, мы рекомендуем время центрифугирования от 16 до 23 часов.
5. Отрежьте конец наконечника пипетки P1000 примерно в 5 мм от острия. С помощью пипетки удалите верхний коричневый слой внутренней мембраны (IM). Переложите фракцию IM в поликарбонатную бутылку для ультрацентрифугирования.
6. Оставьте около 2 мл раствора сахарозы выше границы раздела 53-73%, чтобы убедиться, что нижняя белая наружная мембрана (ОМ) не загрязнена фракцией внутримышечного в/м. Повторите процедуру пипетирования, описанную на шаге 6.4 для фракции ОМ (рис. 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мембраны также можно собрать, проколов иглой центрифужные пробирки на дне и собрав их как фракции по каплям.
7. Заполните оставшуюся пустоту ультрацентрифужной пробирки буфером для хранения с изолированной мембраной и перемешайте путем инверсии или пипетирования. Храните образцы на льду.
8. Соберите промытые и изолированные мембраны с помощью ультрацентрифугирования при 184 500 x g в течение 1 ч при 4 °C.
9. Отбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте мембраны с помощью гомогенизации Dounce. Добавьте 500-1000 μл буфера для хранения. Соберите образцы в микроцентрифужные пробирки объемом 2 мл.
10. Храните образцы бактериальной мембраны при температуре -20 °C.

Результаты

Рисунок 1: Схема, изображающая процедуру выделения мембраны грамотрицательных бактерий, описанную в этой статье о методах. Показана методика, используемая для сбора бактериальных клеток и выделения полной, внутренней (IM) и наружной мембран (OM). Подход о...

Материалы