Визуализация внеклеточных везикул цианобактерий с помощью просвечивающей электронной микроскопии

Аннотация

Источник: Biller, S. J., et al. Выделение и характеристика внеклеточных везикул цианобактерий. J. Vis. Exp. (2022)

В этом видео демонстрируется подготовка внеклеточных везикул цианобактерий к просвечивающей электронной микроскопии путем негативного окрашивания, что позволяет визуализировать морфологию, размер и чистоту везикул с высоким разрешением для структурного и сравнительного анализа.

Протокол

1. Определение характеристик изолированных везикул

1. Выполните просвечивающую электронную микроскопию с отрицательным окрашиванием (см. Таблицу материалов) (TEM - просвечивающая электронная микроскопия; размер, структура, чистота частиц).
   1. Для улучшения качества изображения тлеющий разряд на поверхности сетки с прежним покрытием ПЭМ используется с помощью системы тлеющего разряда в соответствии с рекомендациями производителя (см. Таблицу материалов).
   2. Осторожно нанесите ~5 мкл образца везикулы и оставьте на 5 мин.
      >ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы с концентрацией везикул >10^{9 мл-1}, как правило, дают наилучшие результаты; более разбавленные образцы будут иметь мало везикул на изображение.
   3. Извлеките образец, прикоснувшись краем сетки к листу чистой фильтровальной бумаги.
   4. Нанесите пипеткой каплю 20-50 мкл 2% уранилацетата (см. Таблицу материалов) на плоскую поверхность, покрытую полиэтиленовой пленкой, и поместите плавающую на ней сетку на 2 минуты.
   5. Удалите уранилацетат с помощью фильтровальной бумаги и кратковременно поплавайте на капле сверхчистой воды для мытья. Повторите промывку водой во второй раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная сухая сетка готова к визуализации после шага 1.1.5.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
2% Раствор уранилацетата	Electron Microscopy Sciences	22400-2	Негативное окрашивание - TEM
Carbon Support Film 200 меш, медь. CF200-Cu	Электронная микроскопия Sciences	71150	Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) сетка
easyGlow Система очистки тлеющего разряда	Ted Pella	91000	Коммерческая сетка TEM Разгрузчик
Milli-Q Эталонная система очистки воды	Merck	Z00QSV0WW	Система очистки воды для получения сверхчистой воды типа I
Просвечивающий электронный микроскоп	JEOL	JEM-1400	или аналогичный микроскоп

свечения