1. Забор образцов для экстракции полифосфата
- Выращивание бактерий в условиях интереса для определения содержания полифосфата. Для этого протокола выращивайте Lactobacillus reuteri в течение ночи при температуре 37 °C без встряхивания в среде индукции яблочного фермента (MEI) без цистеина (MEI-C).
- Соберите достаточное количество клеток центрифугированием в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл, чтобы получить в общей сложности 50–100 мкг клеточного белка (см. шаг 3 ниже). Для E. coli это 1 мл культуры логарифмической фазы при A600 от 0,2 до 0,4. Для L. reuteri это 1 мл ночной культуры. При необходимости отрегулируйте для других интересующих видов.
- Полностью удалите надосадочную жидкость из клетки гранулами.
- Ресуспендируйте клеточные гранулы в 250 мкл буфера для лизиса GITC (4 М гуанидина изотиоцианата, 50 мМ Tris-HCl, pH 7) и лизируйте путем инкубации при 95 °C в течение 10 мин. Храните лизаты при -80 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте время лизиса, так как длительная инкубация при высокой температуре может привести к деградации полиP путем гидролиза. Лизаты можно хранить неограниченное время при температуре -80 °C.
ВНИМАНИЕ: Гуанидин изотиоцианат является хаотропной солью, с ним следует обращаться в перчатках и утилизировать как опасные отходы.
2. Измерение содержания белка в клеточных лизатах
- Приготовьте стандарты бычьего сывороточного альбумина (БСА), содержащие 0, 0,1, 0,2 и 0,4 мг мл-1 БСА в буфере для лизиса GITC.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать стандарты BSA в GITC, поскольку GITC влияет на развитие цвета в анализе по Брэдфорду. Стандарты BSA могут храниться неограниченное время при температуре -20 °C. - Аликвота 5 мкл размороженных, хорошо перемешанных клеточных лизатов и стандартов BSA для разделения лунок в прозрачной 96-луночной пластине.
- Добавьте 195 μL реагента Bradford в каждую лунку и измерьте поглощение при 595 нм (A595) в планшетном ридере (см. Таблицу материалов).
- Рассчитайте количество белка в каждой лунке по сравнению со стандартной кривой BSA, используя формулу y = mx + b, где y — A595, x — μг BSA, m — наклон стандартной кривой, а b — y-пересечение стандартной кривой. Умножьте полученное значение на 0,05, чтобы определить общее количество мг белка в каждом образце.
3. Экстракционный полифосфат
:
- Добавьте 250 μл 95% этанола в каждый образец, лизированный GITC, и перемешайте.
- Нанесите эту смесь на спиновую колонку с кремнеземной мембраной и центрифугируйте в течение 30 с при давлении 16 100 x g.
- Откажитесь от проточной части, затем добавьте 750 мкл 5 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 50 мМ NaCl, 5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 50% этанола и центрифугируйте в течение 30 с при 16 100 x г.
- Сбросить проточный канал и центрифугировать на 2 минуты при давлении 16 100 x g.
- Поместите колонку в чистую микрофужерную пробирку объемом 1,5 мл и добавьте 150 мкл 50 мл Tris-HCl (pH 8).
- Инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут, затем элюировать polyP центрифугированием в течение 2 минут при 8 000 x g.
ПРИМЕЧАНИЕ: При желании элюаты можно хранить при температуре -20 °C не менее 1 недели.
4. Разложение полифосфата
- Приготовьте стандарты, содержащие 0, 5, 50 или 200 мкМ фосфата калия в 50 мМ Tris-HCl (pH 8).
ПРИМЕЧАНИЕ: Нормы фосфата калия можно хранить неограниченное время при комнатной температуре. - Аликвота по 100 мкл каждого стандарта фосфата и экстрагированных образцов полиП в отдельные лунки прозрачной 96-луночной пластины.
- Приготовьте мастер-смесь, содержащую (на образец): 30 мкл 5x ScPPX реакционного буфера (100 мМ Tris-HCl, 25 мМ MgCl2, 250 мМ ацетата аммония, pH 7,5)13, 19 мкл H2O и 1 мкл очищенного ScPPX (1 мг мл-1).
- Добавьте по 50 мкл мастер-смеси в каждую лунку 96-луночного планшета. Инкубировать в течение 15 минут при 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: При желании расщепленные образцы polyP можно хранить при температуре -20 °C в течение неограниченного времени.
5. Детектирование свободного фосфата
- Приготовьте детекционный раствор основания, растворив 0,185 г сартрата сурьмы калия в 200 мл воды, добавив 150 мл 4 N H2SO4, затем добавив 1,49 г гептамолибдата аммония. Перемешайте до полного растворения, а затем доведите до конечного объема 456 мл. Отфильтруйте раствор для удаления твердых частиц и храните в защищенном от света месте при температуре 4 °C до 1 месяца.
- Приготовьте в исходном состоянии раствор из 1 М аскорбиновой кислоты. Хранить в защищенном от света месте при температуре 4 °C до 1 месяца.
- Ежедневно готовьте свежий рабочий запас раствора для детектирования, смешивая 9,12 мл основания раствора для детектирования с 0,88 мл 1 М аскорбиновой кислоты. Перед использованием дайте раствору для обнаружения нагреться до комнатной температуры.
- Добавьте 50 мкл детектирующего раствора в каждый образец и стандарт в 96-луночный планшет и инкубируйте при комнатной температуре в течение примерно 2 минут, чтобы обеспечить развитие цвета.
- Измерьте поглощение на длине волны 882 нм с помощью планшетного считывателя и рассчитайте концентрацию фосфатов в каждом образце путем сравнения со стандартной кривой фосфата калия.
ВНИМАНИЕ: Раствор для обнаружения содержит токсичные соли и сильные кислоты. Надевайте перчатки и обращайтесь с излишками раствора как с токсичными отходами.
6. Расчет содержания полифосфата в клетках
- Преобразуйте концентрации фосфатов, определенные на шаге 5.5, в наномоли фосфата, полученного из polyP, в каждом лизате всей клетки по следующей формуле:
nmol polyP = 1,5 x (μM фосфат / 10)
ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартный метод на основе кривой на этапе 5 определяет концентрацию фосфата (в μM) в каждом образце полиP объемом 100 μL, аликвотированном на шаге 4.2. Чтобы перевести эту концентрацию в число нмоль, 100 мкл делят на 106, чтобы получить объем в л, умножают на концентрацию (моль л-1), а затем умножают на 1000 (число нмоль в моль). Это сводится к делению концентрации на 10. Общий объем экстракта, приготовленного на шаге 3, составляет 150 μл, поэтому необходимо умножить полученное значение на 1,5, чтобы рассчитать нмоль фосфата, присутствующего во всей экстракте. - Нормализуйте содержание полиП в клетках до общего клеточного белка путем деления nmol polyP на мг общего белка в каждом образце, определенном на шаге 1.4. Уровни PolyP выражаются в терминах концентрации отдельного свободного фосфата, полученного из polyP.
ПРИМЕЧАНИЕ: В некоторых случаях количество фосфата, полученного из polyP, присутствующего в образце, может выходить за пределы линейного диапазона стандартной кривой фосфатов. Если уровни polyP очень высоки, избыток полиП-содержащего элюата на стадии 3.6 можно разбавить в соотношении 1:10 или 1:100, в зависимости от необходимости, а затем снова измерить, как описано на этапах 4-6.
