Анализ репликации Legionella pneumophila в макрофагах, предварительно обработанных наружными мембранными везикулами

Аннотация

Источник: Jung, A. L. et al., Внешние мембранные везикулы Legionella pneumophila: выделение и анализ их провоспалительного потенциала на макрофагах. J. Vis. Exp. (2017)

В этом видео показана предварительная обработка макрофагов везикулами внешней мембраны (OMV) Legionella pneumophila для изучения их влияния на репликацию бактерий. Изменяя иммунную сигнализацию хозяина, OMV делают макрофаги более восприимчивыми к инфекции. Более высокое количество колоний в обработанных клетках по сравнению с необработанными указывает на то, что OMV способствуют репликации L. pneumophila внутри макрофагов.

Протокол

1. Перед обработкой макрофагов

1. подготовьте клетки THP-1 (клетки больницы Тохоку Педиатрикс-1, клеточная линия моноцитарного лейкоза человека).
   ПРИМЕЧАНИЕ: THP-1 - это моноцитарная клеточная линия, полученная от пациента с лейкемией.
   1. Добавьте 2x10⁵ клеток THP-1 на 24 лунки и дифференцируйте их, добавив 20 нМ форбол 12-миристат 13-ацетат (PMA) в макрофагоподобные клетки. Инкубировать в течение 24 ч при 37 °C.
   2. Замените среду 500 μл свежей среды и инкубируйте еще 24 ч; оптимальная среда для клеток THP-1 состоит из среды Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 с высоким содержанием глюкозы с добавлением 10% эмбриональной сыворотки телят.
2. Выделите макрофаги, полученные из костного мозга мышей (mBMDM).
3. Обрабатывайте макрофаги, полученные из THP-1, или mBMDM с помощью внешних мембранных везикул (OMV).
   1. Разморозьте OMV и добавьте их к человеческим или мышиным макрофагам в соответствии с их количеством белка (0,1, 1 и 10 μг/мл). Инкубируйте макрофаги с OMV при 37 °C в течение не менее 20 ч.

2. Инфицируйте макрофаги и оцените репликацию бактерий с помощью анализа колониеобразующей единицы (КОЕ)

1. Используйте Legionella pneumophila, предварительно обработанные клетки THP-1 или mBMDM из этапа 4.3, а не предварительно обработанные макрофаги в качестве контроля (2x10 5/24 лунки). Не обменивайте носитель.
2. Инфицировать клетки THP-1 L. pneumophila Corby WT и mBMDM с мутантом L. pneumophila Corby, испытывающим недостаток флагеллина (оба с кратностью инфекции (MOI) 0,5; 1x10⁵ L. pneumophila/24 лунки) и инкубировать в течение 24 и 48 ч соответственно.
3. Лизируйте клетки в их среде путем добавления сапонина (конечная концентрация: 0,1%) и инкубируйте при 37 °C в течение 5 минут.
4. Повторно суспендируйте бактерии с помощью пипетирования и перенесите суспензию в реакционный сосуд. Готовят серийные разведения сред, содержащих L. pneumophila, в стерильном фосфатно-солевом буфере (PBS).
5. Разбейте 50 мкл необходимых разведений на агаровых пластинах с буферизированным древесным углем дрожжевым экстрактом (BCYE) и инкубируйте в течение 3 дней при 37 °C.
6. Визуально подсчитайте образовавшиеся колонии. Рассчитайте CFU

<

img class='image_resized' style='aspect-ratio:305/40;width:75%;' src='https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/23949/Equation_1_editor_23949.jpg' alt='Equation_1.jpg' />

Нормализуйте результат подсчета КОЕ для не предварительно обработанных, но инфицированных макрофагов, которые установлены на 100%.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
10 cm petridish	Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Германия)	82.1473
Активированный уголь	Carl Roth GmbH & Co KG (Карлсруэ, Германия)	X865.2
Агар-агар, Kobe I	Carl Roth GmbH & Co KG (Карлсруэ, Германия)	5210.2
Агар колумбийский с 5 % овечьей крови	Becton Dickinson GmbH (Гейдельберг, Германия)	254005
Нонагидрат нитрата железа	Carl Roth GmbH & Co KG (Карлсруэ, Германия)	5632.1
Фетальная телячья сыворотка (FCS)	Life Technologies GmbH (Дармштадт, Германия)	10270-106
Инкубатор углекислого газа Heracell 240i	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Брауншвейг, Германия) 40830469
Heraeus Multifuge X3R	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Брауншвейг, Германия) 75004515
петля инокуляции	Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Германия)	86.1567.010
L. pneumophila Corby	---	---	Любезно предоставлено профессором д-ром Антье Флигером (RKI, Берлин, Германия)
L. pneumophila Corby ΔflaA	---	---	Любезно предоставлено профессором д-ром Клаусом Хойнером (RKI, Берлин, Германия)
mBMDM	------		Любезно предоставлено профессором д-ром Маркусом Шнаре (Университет им. Филиппа Марбурга, Марбург, Германия) и профессором д-ром Карстеном Киршнингом (Университет Дуйсбурга Эссена, Эссен, Германия)
PBS	Biochrom GmbH (Берлин, Германия)	L 1825
Phorbol 12-миристат 13-ацетат	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Тауфкирхен, Германия)	P8139-1MG
Вращающийся шейкер (MaxQ 6000)	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Брауншвейг, Германия)	SHKE6000
RPMI 1640 high glucose	Life Technologies GmbH (Дармштадт, Германия)	11875-093
Saponin	Carl Roth GmbH & Co KG (Карлсруэ, Германия)	9622.1
Ultrospec 10	Biochrom Ltd (Кембридж, Англия)	80-2116-30
THP-1	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Тауфкирхен, Германия)	88081201-1VL
Sorvall Discovery 100 SE	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Брауншвейг, Германия)
Дрожжевой экстракт	Carl Roth GmbH & Co KG (Карлсруэ, Германия)	2363.2