Процедура забора бактерий и механического лизиса

Аннотация

Источник: Mercier, N., et al. Аффинная очистка MS2 в сочетании с секвенированием РНК у грамположительных бактерий. (2021)

В этом видео демонстрируется пошаговая процедура сбора бактериальных клеток и их механического лизиса для высвобождения внутриклеточного содержимого.

Протокол

1. Сбор бактерий

ВНИМАНИЕ: Этот этап включает в себя обработку патогенных бактерий.

1. Вырастите одну колонию штаммов, несущих либо pCN51-P3-MS2-sRNA, либо pCN51-P3-MS2 плазмиды в 3 мл среды для инфузии мозга сердца (BHI) с добавлением эритромицина (10 мкг/мкл) в дубликатах.
2. Разведите каждую ночную культуру в 50 мл (≈1/100) свежей среды BHI с добавлением эритромицина (10 мкг/мкл) до достижения наружного диаметра_{600 нм} 0,05. Используйте стерилизованные колбы объемом 250 мл (соотношение колбы к среде 5:1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Среда и условия роста должны быть установлены в соответствии с характером экспрессии исследуемой мРНК.
3. Выращивайте культуры при температуре 37°C с встряхиванием при 180 об/мин в течение 6 ч.
4. Переложите каждую культуру в центрифужную пробирку объемом 50 мл.
5. Центрифугируйте при давлении 2 900 x g в течение 15 мин при 4°C. Выбросьте надосадочную жидкость.
6. Храните гранулы на льду и непосредственно выполняйте механический лизис клеток или замораживайте и храните гранулы при температуре -80 °C.

2. Механический лизис клеток

ВНИМАНИЕ: Следующие шаги необходимо выполнять на льду, а буферы должны быть при температуре 4 °C. Используйте перчатки и принимайте все меры предосторожности для защиты образцов от РНКазы.

1. Ресуспендируйте гранулы (шаг 1.6) в 5 мл буфера А (150 мМ KCl, 20 мМ Tris-HCl pH 8, 1 мМ MgCl₂ и 1 мМ DTT).
2. Перенесите ресуспендированные элементы в центрифужные пробирки объемом 15 мл с 3,5 г гранул диоксида кремния (0,1 мм).
3. Вставьте трубки в механический инструмент для лизиса клеток. Выполните цикл продолжительностью 40 с со скоростью 4,0 м/с.<бр />ПРИМЕЧАНИЕ: Если одного цикла недостаточно для разрушения ячеек, дайте устройству остыть в течение 5 минут, держа образцы на льду. Затем повторите еще один цикл продолжительностью 40 с со скоростью 4,0 м/с. Эффективность лизиса клеток можно проверить, нанеся надосадочную жидкость на пластину BHI-агара.
4. Центрифугируйте при давлении 15 700 x g в течение 15 мин. Восстановите надосадочную жидкость и держите ее на льду.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
15 мл центрифужные пробирки	Falcon	352070
50 мл центрифужные пробирки	Falcon	352051
250 мл колба для культур	Dominique Dutscher	2515074	Бактериальные культуры
BHI (Brain Heart Infusion) Бульон	Sigma-Aldrich	53286	Питательная среда
Эритромицин (ery)	Sigma-Aldrich	Fluka 45673	Питательная среда
Лизирующая матрица B Bulk	MP Biomedicals	6540-428	Механический лизис
RNAPro Solution	MP Biomedicals	6055050	Механический лизис
FastPrep device	MP Biomedicals	116004500	Спектрофотометр для механического лизиса
Genesys 20	ThermoFisher Scientific	11972278	бактериальных культур