Выделение малой регуляторной РНК-связанной бактериальной целевой РНК с помощью аффинной очистки

Аннотация

Источник: Mercier, N., et. al., MS2-affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria. J. Vis. Exp. (2021)

В этом видео показано выделение меченой MS2 малой регуляторной РНК (мРНК), связанной с ее бактериальной целевой РНК с помощью аффинной очистки с помощью слияния белка мальтозосвязывающего белка (MBP)–MS2, иммобилизованного на амилозной смоле.

Протокол

Буферы и среды

Для экспериментов MAPS приготовьте следующие буферы и среды:- Буфер A (150 мМ KCl, 20 мМ Tris-HCl pH 8, 1 мМ MgCl₂ и 1 мМ DTT)- Буфер E (250 мМ KCl, 20 мМ Tris-HCl pH 8, 12 мМ мальтоза, 0,1% Тритон, 1 мМ MgCl₂ и 1 мМ DTT)

Подготовка колонки

ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не дать амилозной смоле высохнуть. При необходимости загерметизируйте колонну торцевой крышкой. Приготовьте все растворы перед началом аффинной очистки.

1. Поместите хроматографическую колонку в стойку для колонок.
2. Снимите кончик колонки и промойте колонку сверхчистой водой.
3. Добавьте 300 μл амилозной смолы.
4. Промойте колонку 10 мл буфера А.
5. Разведите 1200 пмоль белка MBP (мальтозосвязывающий белок)-MS2 в 6 мл буфера А и загрузите его в колонку.
6. Промойте колонку 10 мл буфера А.

MS2-аффинная очистка (Рисунок 1)

1. Загрузите клеточный лизат в колонку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Храните 1 мл клеточного лизата (сырой экстракт, CE) для извлечения общей РНК и проведите северный блоттинг и транскриптомный анализ.
2. Соберите проточную фракцию (FT) в чистую сборную трубку.
3. Промойте колонку 3 раза 10 мл буфера А. Соберите фракцию промывки (W).
4. Разбавьте колонку 1 мл буфера Е и соберите фракцию элюирования (Е) в микропробирку объемом 2 мл.
5. Храните все собранные фракции на льду до извлечения РНК или замораживайте их при -20 °C для последующего использования.

Результаты

Рисунок 1. Схематическая иллюстрация протокола MAPS, адаптированного к золотистому стафилококку. От конструирования плазмид до анализа данных.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1,5 мл микроцентрифужная пробирка	Sarstedt	72.690.001
15 мл центрифужная пробирка	Falcon	352070
мл микроцентрифужная пробирка	Starstedt	72.691
Колба для культур 250 мл	Dominique Dutscher	2515074	Бактериальные культуры
50 мл центрифужные пробирки	Falcon	352051	Центрифугирование для культур
Амилоза смола	New England BioLabs	E8021S	MS2-аффинная очистка
pMBP-MS2	Addgene	65104	MS2-MBP производство
поли-Prep хроматографическая колонка	BioRad	7311550	Аффинная очистка MS2

2