Методическая статья

Выделение малой регуляторной РНК-связанной бактериальной целевой РНК с помощью аффинной очистки

29 августа 2025 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Mercier, N., et. al., MS2-affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria. J. Vis. Exp. (2021)

В этом видео показано выделение меченой MS2 малой регуляторной РНК (мРНК), связанной с ее бактериальной целевой РНК с помощью аффинной очистки с помощью слияния белка мальтозосвязывающего белка (MBP)–MS2, иммобилизованного на амилозной смоле.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Буферы и среды

Для экспериментов MAPS приготовьте следующие буферы и среды:- Буфер A (150 мМ KCl, 20 мМ Tris-HCl pH 8, 1 мМ MgCl2 и 1 мМ DTT)- Буфер E (250 мМ KCl, 20 мМ Tris-HCl pH 8, 12 мМ мальтоза, 0,1% Тритон, 1 мМ MgCl2 и 1 мМ DTT)

Подготовка колонки

ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не дать амилозной смоле высохнуть. При необходимости загерметизируйте колонну торцевой крышкой. Приготовьте все растворы перед началом аффинной очистки.

  1. Поместите хроматографическую колонку в стойку для колонок.
  2. Снимите кончик колонки и промойте колонку сверхчистой водой.
  3. Добавьте 300 μл амилозной смолы.
  4. Промойте колонку 10 мл буфера А.
  5. Разведите 1200 пмоль белка MBP (мальтозосвязывающий белок)-MS2 в 6 мл буфера А и загрузите его в колонку.
  6. Промойте колонку 10 мл буфера А.

MS2-аффинная очистка (Рисунок 1)

  1. Загрузите клеточный лизат в колонку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Храните 1 мл клеточного лизата (сырой экстракт, CE) для извлечения общей РНК и проведите северный блоттинг и транскриптомный анализ.
  2. Соберите проточную фракцию (FT) в чистую сборную трубку.
  3. Промойте колонку 3 раза 10 мл буфера А. Соберите фракцию промывки (W).
  4. Разбавьте колонку 1 мл буфера Е и соберите фракцию элюирования (Е) в микропробирку объемом 2 мл.
  5. Храните все собранные фракции на льду до извлечения РНК или замораживайте их при -20 °C для последующего использования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
figure-results-1

Рисунок 1. Схематическая иллюстрация протокола MAPS, адаптированного к золотистому стафилококку. От конструирования плазмид до анализа данных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,5 мл микроцентрифужная пробиркаSarstedt72.690.001
15 мл центрифужная пробиркаFalcon352070
мл микроцентрифужная пробиркаStarstedt72.691
Колба для культур 250 млDominique Dutscher2515074Бактериальные культуры
50 мл центрифужные пробиркиFalcon352051Центрифугирование для культур
Амилоза смолаNew England BioLabsE8021SMS2-аффинная очистка
pMBP-MS2Addgene65104MS2-MBP производство
поли-Prep хроматографическая колонкаBioRad7311550Аффинная очистка MS2
2

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

MS2MS2

Похожие статьи