$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Подготовка бактериальных штаммов или мутантных библиотек
1. Выделите штаммы, которые будут протестированы, на соответствующих агаровых пластинах. Это готовые пластины для эксперимента.
1. Инкубируйте пластины в течение ночи при желаемой температуре, чтобы получить одиночные колонии. Для этого эксперимента культивировали K. pneumoniae (NTUH-K2044 и ATCC43816 штаммы) на агаре из бульона Лурия (LB) при 37 °C, а S. pneumoniae (23F дикого типа и 23F Δcps) на кровяном агаре в увлажненной банке для свечей при 37 °C.
2. Выберите одну колонию из бульонной тарелки (шаг 1.1), чтобы ввести 10 мл подходящего бульона с помощью стерильной петли или коктейльной палочки. Для скрининга случайных мутантных библиотек инокулируйте бульон 10 мкл запаса случайных мутантных библиотек (TraDIS Library).
1. Инкубируйте штаммы K. pneumoniae в среде с низким содержанием соли LB при 37 °C с встряхиванием, а штаммы S. pneumoniae в среде для инфузии сердца мозга (BHI) статически при 37 °C.
2. Перенесите ночную культуру в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте в настольной центрифуге в течение 10 минут при давлении 3,200 x g в распашных ведре с вкладышами для пробирок объемом 15 мл и аэрозольными герметичными крышками.
3. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 2 мл 1x фосфатно-солевого буфера (PBS).
ПРИМЕЧАНИЕ: Утилизируйте надосадочную жидкость через соответствующий путь жидких биологических отходов в лаборатории. Целью этапов центрифугирования и ресуспендирования (1.2.2 и 1.2.3) является концентрация бактерий для легкой визуализации на градиенте. При желании бактериальные культуры могут быть загружены непосредственно на градиент. Сильно капсулированные штаммы могут не образовывать плотную гранулу. В этом случае удалите как можно больше надосадочной жидкости, не удаляя бактериальные клетки, добавьте 1x PBS до конечного объема 5 мл и повторно суспендируйте гранулу. Продолжите протокол с шага 1.2.5.
5. Центрифугируйте пробирки, как описано в шаге 1.2.2.
6. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 2 мл 1x PBS. Теперь ячейки готовы к использованию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность суспензии бактериальных клеток не критична, но должна быть достаточной для визуализации в градиенте. Рекомендуется минимальный внешний диаметр600 (оптическая плотность на длине волны 600 нм) 4.