Разделение бактерий по количеству капсул с помощью прерывистого градиента плотности

Аннотация

Источник: Feltwell, T., et.al. Разделение бактерий по количеству капсул с помощью прерывистого градиента плотности. J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео демонстрируется использование прерывистого градиента плотности для разделения бактериальных штаммов в зависимости от количества капсулы. Центрифугируя библиотеку транспозонных мутантов через градиент, бактерии с разной плотностью капсул локализуются в различных слоях. Затем отделенные фракции могут быть собраны для последующего анализа.

Протокол

1. Добавление подготовленных ячеек в градиенты и разделение центрифугированием

:

1. добавьте 600 мкл подготовленных ячеек в верхнюю часть градиента в пробирке очень медленно и не перемешивая границу раздела.
2. Поместите трубки в адаптеры для трубок и взвесьте комбинированные адаптеры и трубки, чтобы убедиться, что они сбалансированы.
   1. Поместите адаптеры для трубок в ротор с фиксированным углом наклона внутри настольной центрифуги. Центрифуга в течение 30 мин при 3 000 x g.
   2. После центрифугирования осторожно извлеките пробирки, поместите их в подходящий штатив и сфотографируйте результаты в виде записи.
3. Восстановите бактериальные фракции для количественного определения уроновой кислоты или экстракции ДНК.
   1. Если последующие приложения не требуются, утилизируйте образцы/градиенты по соответствующему маршруту жидких биологических отходов в лаборатории.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно проверить разделение для новых видов/штаммов бактерий. Отдельные фракции градиента должны быть исследованы с помощью микроскопии, анализа уроновой кислоты или другого подходящего количественного анализа для подтверждения капсульного фенотипа каждой фракции. Если целью является разделение на основе агрегации или размера клеток, следует использовать независимые соответствующие анализы.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Центрифуга 5810R с ротором A-4-81 и ведрами объемом 500 мл	Eppendorf	5810 718.007
Адаптеры для пробирок 15 мл	Eppendorf	5810 722.004
Ротор с фиксированным углом наклона F-34-6-38	Eppendorf	5804 727.002
2.6 - 7 мл адаптер для пробирки	Eppendorf	5804 739.000
Центрифуга 5424, включая ротор FA-45-24-11	Eppendorf	5424 000.460
5 мл полипропиленовая трубка с круглым дном	Falcon	352063