Аптамер-акусторез для микрофлюидного разделения грамотрицательных бактерий

Аннотация

Источник: Choi, H. J., et al. Микрофлюидный акустофорез для проточного разделения грамотрицательных бактерий с использованием аффинных гранул аптамера. J. Vis. Exp. (2022)

В этом видео демонстрируется метод селективного отделения грамотрицательных бактерий от смешанного бактериального образца с использованием микрогранул, покрытых аптамером, и акустических сил внутри микрофлюидного чипа.

Протокол

1. Настройка и эксплуатация акустофореза
   1. Подключите трубки из полиэфирэфиркетона (PEEK) к двум входам для ввода двух образцов и буфера, а также к двум выходам для сбора и выгрузки отходов (Рисунок 1).
   2. Вручную заполните микрофлюидный акустофорезный канал деминерализованной водой без пузырьков с помощью шприца объемом 10 мл.
   3. Подготовьте прецизионный регулятор давления с двумя или более выходными каналами для управления потоком жидкости. Затем наполовину заполните флаконы образцом и буфером, соответственно, с двумя отверстиями в крышках, и подключите их к входному отверстию чипа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Прецизионный регулятор давления с двумя или более выходными каналами может быть заменен несколькими прецизионными регуляторами давления. На входе в буфер через регулятор потока подается буфер, способный генерировать ламинарный поток, препятствующий перемещению образца к центру во время впрыска образца.
   4. После подготовки устройства введите образец и буфер, создав давление 2 кПа на входе образца и 4 кПа на входе в буфер с помощью прецизионного устройства контроля давления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В это время для плавного ламинарного потока давление впрыска буфера должно быть выше, чем давление впрыска образца. Управление потоком осуществляется с помощью регулятора потока, закрепленного на аспираторе, подключенном к входному каналу.
   5. Сфокусируйтесь на бусине с помощью пьезоэлектрического преобразователя (PZT), чтобы переместить ее в центр микрофлюидного канала, проверяя ее через микроскоп.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чем больше бусина, тем больше влияние на форму волны, поэтому ее легче выровнять по точке узла. Функциональный генератор с усилителем подает питание на PZT для генерации синусоидальной волны в микроканале. Поскольку верхняя и нижняя части микроканала выполнены из стекла, генерируемая синусоида отражается и создает узловую точку.
   6. Используя одноканальный функциональный генератор, сгенерируйте резонансную частоту 3,66 МГц и усилите типичный сигнал на 16 дБ (примерно в девять раз) с помощью усилителя мощности (рис. 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Резонансная частота привода должна соответствовать размеру канала, поскольку канал имеет квадратную форму, PZT работает с точной частотой для создания одного узла.
   7. Наблюдайте за процессами разделения и обогащения на акустофлюидном чипе с помощью флуоресцентного микроскопа и высокоскоростной камеры, работающей со скоростью 1200 кадров в секунду.
   8. Количественно оцените и проанализируйте наличие или отсутствие грамотрицательных (ГН) и грамположительных (ГП) бактерий, проверив изображения, сделанные с помощью флуоресцентного микроскопа связанных с бактериями шариков и бактерий, выпущенных через образцы для сбора и выпуска отходов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Микрошарики с буфером, бактериями и аптамерами проходят через основной канал, и микрошарики выравниваются по центру с помощью внутричипового акустофореза, индуцированного PZT. Наконец, микрогранулы, которые имеют связанные бактерии GN, собираются на выходе для сбора, а несобранные бактерии выводятся через выпускное отверстие для отходов.

Результаты

Рисунок 1: Схема акустофлюидной системы, используемой для разделения и сбора клеток. Проба или буферный раствор впрыскивается во входное отверстие через регулятор расхода. Для центрирования валиков и разделения образцов питание переменно...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
10 μm микрогранулы со стрептавидиновым покрытием	Bang Laboratories	CP01007	Aptamer affinity beads
Aptamer	Integrated DNA Technologies	GN3-6'RNA	для конъюгации бактерий
Escherichia coli DH5α	KCTC	KCTC2571	Целевые бактерии
Функциональный генератор	GW Instek	AFG-2225	Генератор частоты
Высокоскоростная камера	Photron	FASTCAM Mini	Наблюдение за разделением
KOVAX-ШПРИЦ 10 мл Шприц	Koreavaccine	22G-10ML	Заполните микрофлюидный акустофорезный канал деминерализованной водой без пузырьков.
Микроскоп	Olympus Corp.	IX-81	Наблюдение за разделением
труб PEEK Tubes	Saint-Gobain Ppl Corp.	AAD04103	Впрыск или сбор частиц
Пьезоэлектрический преобразователь	Fuji Ceramics	C-213	Генерация удельной волны в канале
Усилитель мощности	Усилитель Research	75A250A	Усиление частоты
Регулятор давления/μflucon	AMED	AMED-μflucon	Управление регулятором давления/расхода воздуха